Kinaza kazeinowa 1 izoforma epsilon
| CSNK1E | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Identyfikatory | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| , CKIepsilon, HCKIE, kinaza kazeinowa 1 izoforma epsilon, kinaza kazeinowa 1 epsilon, | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| identyfikatory zewnętrzne CKIe | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Wikidane | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Izoforma kinazy kazeinowej I epsilon lub CK1ε jest enzymem kodowanym przez gen CSNK1E u ludzi. Jest to ssaczy homolog podwójnego czasu . CK1ε jest kinazą białkową serynowo/treoninową i jest bardzo wysoce konserwatywna; dlatego ta kinaza jest bardzo podobna do innych członków rodziny kinaz kazeinowych 1 , z których występuje siedem izoform ssaków (α, β, γ1, γ2, γ3, δ i ε). CK1ε jest najbardziej podobny do CK1δ pod względem struktury i funkcji, ponieważ oba enzymy utrzymują wysokie podobieństwo sekwencji w swoich domenach regulatorowych C-końcowych i katalitycznych . Gen ten jest głównym składnikiem oscylatora ssaków , który kontroluje komórkowe rytmy okołodobowe . CK1ε jest również zaangażowany w modulowanie różnych problemów zdrowotnych człowieka, takich jak rak, choroby neurodegeneracyjne i cukrzyca.
Odkrycie
Mutacja CK1ε-tau
mutacja CK1ε-tau została po raz pierwszy odkryta przez Michaela Menakera i Martina Ralpha w 1988 roku podczas badania laboratoryjnej dostawy chomików syryjskich . Zaobserwowali chomika z nieprawidłowym okresem okołodobowym, a po rozmnażaniu i dalszej charakteryzacji obaj zdali sobie sprawę, że mutacja u chomików spowodowała krótszy niż normalny okres swobodnego biegania . Przypisali ten fenotyp temu, co nazwali „mutacją tau”, która była pierwszym pełnym opisem mutanta okołodobowego ssaków. Odkrycie to dostarczyło innym naukowcom narzędzia do prowadzenia badań nad zegarami biologicznymi i było ważnym wczesnym osiągnięciem w tej dziedzinie.
Sklonowano ludzki CK1ε
W 1995 roku ludzka postać CK1ε została po raz pierwszy wyizolowana i sklonowana przez laboratorium Virshup na Uniwersytecie Utah. Został oficjalnie zidentyfikowany jako izoforma rodziny kinaz kazeinowych 1. U szczurów znaleziono trzy warianty transkryptu kodujące to samo białko dla tego genu: CK1ε1, CK1ε2 i CK1ε3; a dwa znaleziono u ludzi.
Mapowanie genów
W 2000 roku gen CK1ε został później zmapowany i zidentyfikowany przez Josepha Takahashiego i współpracowników, którzy za pomocą genetycznie ukierunkowanej analizy różnic reprezentacyjnych odkryli, że mutacja tau była zlokalizowana w genie CK1ε. Stwierdzono, że gen CK1ε jest podobny do genu podwójnego czasu u Drosophila , który został po raz pierwszy scharakteryzowany i włączony do funkcji zegara biologicznego przez Michaela Younga i współpracowników w 1998 r. U ludzi gen CSNK1E lokalizuje się w 22q13.1 i składa się z 12 eksonów .
Obrazowanie strukturalne
Obrazowanie strukturalne CK1ε zostało przeprowadzone w 2012 roku przez Alexandra Longa i współpracowników przy użyciu krystalografii rentgenowskiej . Następnie potwierdzono pewne motywy strukturalne związane z kinazą, takie jak motyw nici β-skręt-β, który zakotwicza ATP, motyw DFG, który orientuje fosforany ATP, pętla katalityczna przypominająca pętlę PKA i główne miejsca rozpoznawania substratów w domena C-końcowa.
Struktura
Trójwymiarowe struktury domen katalitycznych ssaczych CK1δ i CK1ε zostały po raz pierwszy rozwiązane za pomocą krystalografii rentgenowskiej odpowiednio w 1996 i 2012 roku. Kinaza CK1 ma wiele izoform, w tym łącznie siedem scharakteryzowanych izoform u ssaków (alfa, beta, gamma1-3, delta i epsilon. Różne izoformy różnią się głównie długością i strukturą C-końcowego regionu niekatalitycznego. Tylko wykazano, że izoformy delta i epsilon odgrywają ważną rolę w regulacji rytmu okołodobowego.
CK1δ i CK1ε mają bardzo podobny wzór w swoich strukturach. Pętla P bogata w glicynę znajduje się pomiędzy niciami β1 i β2, tworząc klasyczny motyw nici β-skręt-skręt-β, który zakotwicza i zaciska alfa-fosforan ATP. CK1δ / ε dodatkowo mają wspólne cechy konserwatywne w domenie katalitycznej , które składają się zarówno z płata N-końcowego, jak i α-helikalnego płata C-końcowego. Centrum katalityczne znajduje się w obszarze szczeliny między dwoma płatami, co również wiąże się z nukleotydem i substratem. Wszystkie znane inhibitory wiążą się z tym centrum, blokując wiązanie ATP.
Funkcjonować
Funkcja enzymatyczna
Białko kodowane przez gen epsilon kinazy kazeinowej 1 jest kinazą białkową serynowo/treoninową i członkiem rodziny białek kinazy kazeinowej I, której członkowie biorą udział w kontroli procesów cytoplazmatycznych i jądrowych , w tym replikacji i naprawy DNA . Podobnie jak inni członkowie rodziny białek kinazy kazeinowej 1, kinaza kazeinowa 1 epsilon rozpoznaje Ser (p) XXSer / Thr do fosforylacji . Znajduje się w cytoplazmie jako monomer i może fosforylować różne białka, w tym siebie. Ta autofosforylacja zachodzi w domenie C-końcowej białka , regionie uważanym za zachowujący się jak pseudosubstrat i hamuje aktywność kinazy.
Zegar dobowy
Białko epsilon kinazy kazeinowej 1 jest częścią oscylatora ssaków , grupy białek, które utrzymują komórki w mniej więcej 24-godzinnym harmonogramie. Ten oscylator lub „zegar okołodobowy” składa się z pętli sprzężenia zwrotnego transkrypcji i translacji (TTFL), w której kilka białek pracuje w tandemie, z których każde reguluje ekspresję innych, aby wygenerować mniej więcej 24-godzinny cykl poziomów mRNA i białek . TTFL generuje również mniej więcej 24-godzinne rytmy wyjść, takich jak poziomy uwalniania hormonów komórkowych. transkrypcji białek i mRNA zaobserwowano w wielu komórkach, w tym w głównym zegarze ssaków znanym jako jądro nadskrzyżowaniowe (SCN). Jednak w przeciwieństwie do większości białek rytmu okołodobowego, których ekspresja oscyluje , kinaza kazeinowa 1 epsilon jest konstytutywnie aktywna.
Białka rdzeniowe, które zawierają ssacze TTFL, obejmują okres (PER), kryptochrom (CRY), BMAL1 , CLOCK i kinazę kazeinową 1 epsilon. BMAL1 i CLOCK działają na rzecz zwiększenia transkrypcji PER i CRY, tworząc heterodimer i wiążąc się z domeną E-box w górę od sekwencji kodujących geny PER i CRY. Poziomy PER i CRY są regulowane przez ujemne sprzężenie zwrotne, co oznacza, że hamują one własną transkrypcję. Fosforylacja białek PER przez CK1ε zarówno w cytoplazmie, jak i jądrze oznacza te białka do degradacji. Fosforylacja utrudnia również zdolność PER do wejścia do jądra poprzez indukowanie zmiany konformacyjnej w jego sekwencji lokalizacji jądrowej . Z drugiej strony kompleks białek FBXL3 pośredniczy w degradacji białek CRY w cytoplazmie i jądrze. Jeśli CRY zwiąże się z PER, zanim zostanie ufosforylowane przez CK1ε, te trzy białka stabilizują się w kompleks, który może wejść do jądra. Wewnątrz jądra PER i CRY hamują własną transkrypcję, podczas gdy kinaza kazeinowa 1 epsilon moduluje aktywność BMAL1 i CLOCK poprzez fosforylację.
Jak wspomniano wcześniej, domena C-końcowa kinazy kazeinowej 1 epsilon zachowuje się jak pseudosubstrat po ufosforylowaniu, hamując aktywność kinazy. Wykazano również, że domena C-końcowa jest defosforylowana przez fosfatazy , takie jak fosfataza białkowa 1 (PP1) in vitro i hodowla komórkowa, która reguluje poziomy aktywnej kinazy kazeinowej in vivo . Obecna teoria rytmów okołodobowych stawia hipotezę, że ten cykl fosforylacji / defosforylacji kinazy kazeinowej 1 epsilon jest ważny w modulacji okresu rytmów okołodobowych w komórce, przy czym zwiększona fosforylacja zmniejsza aktywność kinazy kazeinowej 1 epsilon (a następnie zwiększa aktywny CRY i PER) i defosforylacja kinazy kazeinowej 1 epsilon skutkująca bardziej aktywną kinazą (i niższym poziomem aktywnych CRY i PER).
U myszy wykazano, że kinaza kazeinowa 1 epsilon fosforyluje zarówno PER1 , jak i PER2 , jak również CRY1 i CRY2 . Kinaza kazeinowa 1 powoduje cykliczną ekspresję białek oscylatora ssaków, w wyniku czego powstaje chronometrażysta (oscylator ssaków) dla komórki:
| Poziom białka | Natychmiastowy wynik | Opóźniony wynik | |
|---|---|---|---|
| Świt (7 rano) | niskie stężenie białka PER i CRY | Per i Cry (gen) aktywnie transkrybowane i stymulowane przez czynniki transkrypcyjne BMAL1 i CLOCK | Nie dotyczy |
| Zmierzch (19:00) | wysokie stężenie białka PER i CRY | wysokie poziomy białek PER i CRY hamują transkrypcję genów Per i Cry | kinaza kazeinowa 1 epsilon fosforyluje PER i CRY, oznaczając białko do degradacji: stężenie białek PER i CRY spada |
Mutacje funkcji okołodobowej
Wybitnym fenotypem chomików z mutacją tau CK1ε odkrytym przez Menakera był niezwykle krótki okres swobodnego biegu - 22 godziny u heterozygot i 20 godzin u homozygot pod względem mutacji - czyniąc ten allel półdominującym . Gen CK1ε został później zmapowany i zidentyfikowany przez Josepha Takahashiego i współpracowników, co ujawniło mutację substytucyjną C-to-T pojedynczej pary zasad w genie chomika CK1ε. Ten polimorfizm pojedynczego nukleotydu (SNP) skutkuje substytucją argininy na cysteinę w regionie domeny rozpoznawania fosforanów CK1ε, wysoce konserwatywnym regionie genu u ssaków. Obecnie nie jest jasne, w jaki sposób dokładnie mutacja CK1ε-tau powoduje krótszy okres swobodnego biegu . Jednak zasugerowano, że mutacja tau jest mutacją polegającą na wzmocnieniu funkcji, prowadzącą do zwiększonej fosforylacji niektórych miejsc PER, zwiększając w ten sposób szybkość degradacji PER i skracając okres dobowy. Mutacja CK1ε-tau u chomików była pierwszym pełnym opisem mutanta okołodobowego u ssaków.
U ludzi mutacje wpływające na miejsce fosforylacji PER2 genu CK1ε i/lub CK1δ skutkują rodzinnym zespołem zaawansowanej fazy snu (FASPS). Ta mutacja, S662G, która powoduje utratę pojedynczego miejsca akceptora fosforanu na PER2, zapobiega wiązaniu się białka CK1ε z PER i prowadzi do niezwykle krótkiego okresu okołodobowego.
Dodatkowo, dziedziczna mutacja w ludzkim CK1δ, T44A, została zidentyfikowana jako kolejna mutacja powodująca skrócenie okresu i została zidentyfikowana jako inny mechanizm powodujący FASPS. Ta mutacja zmniejsza aktywność CK1δ in vivo u ludzi i podobnie wykazano, że robi to samo u myszy. Jednak eksperymenty na innych gatunkach, takich jak muchy, wykazały, że mutacja ta wywołuje efekty wydłużające okres.
Ponadto wykazano, że u ludzi mutacje P415A i H417R w PER3 destabilizują białko. Wykazano, że mutacje te generują FASPS i są również związane z zaburzeniami regulacji nastroju.
Kompensacja temperatury
CK1δ/ε jest kompensowany temperaturowo, co jest cechą wielu rytmów okołodobowych. Zdolność CK1δ/ε do fosforylacji swoich substratów pozostaje stała nawet przy wahaniach temperatury, podczas gdy normalne szybkości reakcji mają tendencję do wzrostu wraz ze wzrostem temperatury. Ponadto mutanty tau CK1ε wykazują utratę kompensacji temperatury.
Homologi inne niż ssaki
Dwa funkcjonalne homologi rytmu okołodobowego tego białka ssaków można znaleźć u Drosophila melanogaster (muszka owocowa). Funkcjonalne homologi odnoszą się do białek, które mają podobną funkcję u innego zwierzęcia, ale niekoniecznie są genetycznie podobne .
Jeden gen, kodujący białko Doubletime (w skrócie dbt ), służy podobnemu celowi jak kinaza kazeinowa 1 epsilon w chronobiologii , ponieważ odgrywa rolę w fosforylacji PER . Jednak jego sekwencja genów nie wykazuje homologii sekwencji. Ponadto, kinaza kazeinowa 1 epsilon nie ratuje całkowicie rytmów okołodobowych u muszek owocówek z podwójnym nokautem ( dbt -/- ), co sugeruje, że enzymy te pełnią podobne, ale nie identyczne funkcje.
Inny funkcjonalny homolog, gen Drosophila dla kinazy 3 syntazy glikogenu (GSK3), zwany kudłaty i w skrócie sgg, koduje białko, które fosforyluje Timeless (TIM), funkcjonalny homolog muszki owocówki CRY . Podobnie jak dbt , kudłaty nie jest homologiem sekwencji kinazy kazeinowej 1 epsilon. I odwrotnie, Gsk3 występuje również u ssaków, a mutanty są zaangażowane w nieprawidłowości rytmu okołodobowego u pacjentów cierpiących na chorobę afektywną dwubiegunową .
Genom Drosophila melanogaster zawiera inne enzymy z rodziny kinaz kazeinowych 1, które, jak się uważa, nie pełnią żadnej funkcji okołodobowej. Jednak inny enzym z rodziny kinaz kazeinowych, kinaza kazeinowa 2 alfa, jest zaangażowany w zapewnianie początkowej fosforylacji reszty seryny, która jest rozpoznawana zarówno przez DBT, jak i Shaggy'ego dla sekwencyjnej fosforylacji PER i TIM.
Znaczenie CK1δ
Podczas gdy CK1ε był tradycyjnie uważany za główny regulator fosforylacji PER i CRY, uważa się, że izoforma delta kinazy kazeinowej 1 ( CK1δ lub CSNK1D ), izoforma , odgrywa podobną rolę w TTFL. Zarówno CK1ε, jak i CK1δ fosforylują i destabilizują PER in vitro, jak również oddziałują z PER i CRY in vivo. Ponadto wykazano, że CK1δ lepiej oddziałuje z białkami zegara molekularnego drosophila niż CK1ε, co wskazuje, że CK1δ może być bardziej homologiczny do dbt niż CK1ε. Ponadto spektrometria mas wykazała, że CK1δ jest ponad 20 razy liczniejszy niż CK1ε w wątrobie.
Mechanizm fosfoprzełącznika
fosforylacja PER2 jest regulowana przez mechanizm fosfoprzełącznika. Konkretnie, PER2 wymaga wstępnej fosforylacji, aby mógł być fosforylowany, a następnie degradowany przez CK1δ i/lub CK1ε. W ten sposób czasowo sekwencjonowane fosforylacje PER2 opóźniają tempo jego degradacji i mogą zapewnić wgląd w kompensację temperatury zegara okołodobowego. CK1δ i/lub CK1ε mogą zapewniać działanie torujące. Miejsce FASP na PER2 jest kluczowym celem tej pierwotnej aktywności kinazy. Mutacje w tym miejscu mogą wpływać na zdolność PER2 do przyjmowania pierwotnej fosforylacji, prowadząc do wydłużenia lub skrócenia okresu. Inne badania sugerują, że fosforylacja PER2 w dół strumienia prowadzi do stabilizujących interakcji, które zmniejszają szybkość degradacji PER. Uważa się, że wydłuża to okres zegara dobowego. Uważa się, że mutacje w obszarze fosforylacji PER2 są związane z pacjentami z FASPS
Inne funkcje
Kanoniczna ścieżka Wnt
Kanoniczny szlak Wnt polega na gromadzeniu się w cytoplazmie β-kateniny , która aktywuje czynniki transkrypcyjne. Kinaza kazeinowa 1 epsilon i pokrewna kinaza kazeinowa 1 delta są defosforylowane na tym szlaku. Defosforylacja kinazy kazeinowej 1 epsilon jest prawdopodobnie osiągana przez fosfatazę białkową 2 (PP2A), która zwiększa aktywność kinazy obu enzymów in vivo. Kinaza kazeinowa 1 epsilon i kinaza kazeinowa 1 delta są zaangażowane w zwiększanie stabilności β-kateniny w cytoplazmie, chociaż badania mechanizmu tej stabilizacji są niejednoznaczne. Obecna teoria dotycząca tego, jak kinaza kazeinowa 1 epsilon i/lub kinaza kazeinowa 1 delta działają w tym szlaku, głosi, że obie kinazy kazeinowe albo bezpośrednio stabilizują β-kateninę poprzez pozytywną regulację, albo pośrednio stabilizują β-kateninę poprzez ujemną regulację β-kateniny. kompleks degradacji kateniny ( proteaza ).
Rak
Wiadomo, że kinaza kazeinowa 1 epsilon i delta fosforylują białko supresorowe nowotworu , p53 in vivo zarówno u ludzi, jak i mysich lub szczurów starego świata. CK1 fosforyluje p53 na swoim N-końcu, aby wywołać jego aktywację, co następnie zwiększa zatrzymanie cyklu komórkowego i apoptozę . Wykazano, że uszkodzenie DNA aktywuje p53 poprzez zwiększoną aktywację CK1. Inaktywacja CK1 prowadzi do zmniejszenia odporności na apoptozę.
Uważa się również, że kinaza kazeinowa 1 epsilon pośrednio powoduje raka poprzez regulację białka związanego z Yes (YAP), onkogenu i regulatora wielkości narządów. Po pobudzeniu przez fosforylację przez kinazę serynowo-treoninową LATS , wykazano, że zarówno kinaza kazeinowa 1 epsilon, jak i kinaza kazeinowa 1 delta fosforylują YAP i zaznaczają go do ubikwitynacji i degradacji.
Uzależnienie
Kilka badań wykazało związek między molekularnymi składnikami zegara okołodobowego a zaburzeniami psychicznymi, zwłaszcza nadużywaniem narkotyków. Badania asocjacji genetycznych u ludzi wykazały związek CK1ε/CK1δ z rozwojem uzależnień od metamfetaminy, heroiny i alkoholu. Ponadto badania na myszach ujawniają związek między aktywnością CK1ε/CK1δ a stymulującym efektem metamfetaminy. Ponadto wykazano, że hamowanie CK1ε/CK1δ u gryzoni zmniejsza nawroty picia alkoholu i opiatów podczas odstawienia.
Interakcje
Wykazano, że kinaza kazeinowa 1 epsilon oddziałuje z PER1 , PER2 , CRY1 , CRY2 , BMAL1 , CLOCK , NPAS2 i AXIN1 . PER1, PER2 i BMAL1 mogą być bezpośrednio fosforylowane przez CK1ɛ, podczas gdy PER3, CRY1 i CRY2 mogą być fosforylowane przez CK1ɛ tylko w połączeniu z PER1 lub PER2.
Inhibitory
Firmy biotechnologiczne wyprodukowały kilka inhibitorów w celu ułatwienia badań nad funkcją kinazy kazeinowej 1 epsilon. Badania z wykorzystaniem inhibitorów CK1ε potwierdziły udział CK1ε w wielu procesach, zwłaszcza w regulacji rytmów okołodobowych.
Pf-670462 i PF-4800567
PF-670462, opracowany przez firmę Pfizer , jest dobrze scharakteryzowanym inhibitorem zarówno CK1ε, jak i CK1δ, który, jak wykazano, wydłuża okres rytmów okołodobowych, gdy jest podawany in vitro fibroblastom szczura i komórkom COS oraz myszom in vivo . PF-4800567 , również opracowany przez firmę Pfizer, jest swoistym inhibitorem CK1ε. Jednak jego zdolność do wydłużania rytmów okołodobowych jest słabsza niż PF-670462 zarówno w fibroblastów szczurów in vitro, jak i myszy in vivo . Mechanizmy hamowania PF-670462 i PF-4800567 różnią się również między dwiema cząsteczkami. PF-670462 utrzymuje CK1ε/δ z motywem DFG skierowanym do wewnątrz, podczas gdy PF-4800567 oddziałuje hydrofobowo z CK1ε/δ, obracając motyw DFG na zewnątrz, co wskazuje na kinazę typu II.
IC261
IC261 jest inhibitorem, którego celem jest miejsce wiązania ATP zarówno CK1δ, jak i CK1ε. Podobnie wykazano, że wydłuża okres okołodobowy w fibroblastach szczurów i jest zaangażowany w terapie leczenia raka trzustki i raka neuroblastomicznego.
Inni
Scharakteryzowano, że inne inhibitory CK1, takie jak D4476 i analogi pirazolopirydyny, które są ukierunkowane na CK1δ, mają zdolności terapeutyczne, ale ich korzystne działanie nie jest dobrze zbadane i może wynikać z innych celów komórkowych .