Deamidacja
Deamidacja to reakcja chemiczna, w której amidowa grupa funkcyjna w łańcuchu bocznym aminokwasów asparaginy lub glutaminy jest usuwana lub przekształcana w inną grupę funkcyjną. Zazwyczaj asparagina jest przekształcana w kwas asparaginowy lub kwas izoasparaginowy . Glutamina jest przekształcana w kwas glutaminowy lub kwas piroglutaminowy (5-oksoprolina). W białku lub peptydzie reakcje te są ważne, ponieważ mogą zmienić jego strukturę, stabilność lub funkcję i mogą prowadzić do degradacji białka. Przemiana chemiczna netto polega na dodaniu grupy wodnej i usunięciu grupy amonowej, co odpowiada wzrostowi masy o +1 (0,98402) Da. Chociaż deamidacja zachodzi na glutaminie, glikozylowanej asparaginie i innych amidach, są one pomijalne w typowych warunkach proteolizy.
Podczas deamidacji reszty asparaginy w warunkach fizjologicznych łańcuch boczny jest atakowany przez atom azotu następującej grupy peptydów (czarny prawy górny róg rysunku), tworząc asymetryczny sukcynoimidowy związek pośredni (czerwony ) . Asymetria półproduktu skutkuje dwoma produktami jego hydrolizy, kwasem asparaginowym (czarny po lewej) lub kwasem izoasparaginowym, który jest aminokwasem beta (zielony na dole po prawej). Istnieje jednak obawa, że kwas asparaginowy może ulegać izomeryzacji po dezamidowaniu. glutarimidowego z sześcioczłonowym pierścieniem jest mniej korzystne niż pośredni sukcynoimid dla asparaginy. Ogólnie, deamidację można wyeliminować przez proteolizę przy kwaśnym lub lekko zasadowym pH (odpowiednio 4,5 i 8,0) z użyciem endoproteazy Glu-C.
Szybkość dezamidacji zależy od wielu czynników, w tym sekwencji pierwszorzędowych i struktur wyższego rzędu białek, pH, temperatury i składników roztworów. Większość potencjalnych miejsc deamidacji jest stabilizowana przez strukturę wyższego rzędu. Asn-Gly (NG) jest najbardziej elastyczny, a ponieważ jest kwaśny, jest najbardziej podatny na deamidację z okresem półtrwania około 24 godzin w warunkach fizjologicznych (pH 7,4, 37 ° C).
Jako wolny aminokwas lub jako N-końcowa reszta peptydu lub białka, glutamina deamidanuje łatwo, tworząc kwas piroglutaminowy (5-oksoprolina). Reakcja przebiega poprzez nukleofilowy atak grupy α-aminowej na amid łańcucha bocznego, z wytworzeniem γ-laktamu z eliminacją amoniaku z łańcucha bocznego.
Metoda analityczna
Deamidowanie białek było powszechnie analizowane metodą chromatografii cieczowej z odwróconą fazą (RPLC) poprzez mapowanie peptydów. Niedawno zgłoszona nowa metoda ERLIC-MS/MS poprawiłaby rozdział dezamidowanych i niedeamidowanych peptydów dzięki zwiększonej identyfikacji i kwantyfikacji ilościowej.
Spektrometria mas jest powszechnie stosowana do charakteryzowania stanów deamidacji białek, w tym terapeutycznych przeciwciał monoklonalnych. Technika ta jest szczególnie przydatna do analizy deamidacji ze względu na jej wysoką czułość, szybkość i specyficzność. Pozwala to na analizę dezamidowania specyficzną dla miejsca.
Głównym wyzwaniem związanym ze spektrometrią mas jest powstawanie artefaktów deamidacji podczas przygotowywania próbki. Te artefakty znacznie zniekształcają wyniki, ponieważ sugerują większe tempo spontanicznej deamidacji niż to, co jest naprawdę obserwowane. Może to okazać się problematyczne w przypadku białek terapeutycznych, które mogą zostać błędnie scharakteryzowane w protokołach kontroli jakości, jeśli duży procent wykrytej deamidacji jest spowodowany artefaktami. Ostatnie badania wskazują, że niższe pH może zmniejszyć szybkość artefaktów deamidacji.
Kinetyka deamidowania
Przypuszcza się, że reakcje deamidacji są jednym z czynników ograniczających użyteczny czas życia białek.
Deamidacja przebiega znacznie szybciej, jeśli po wrażliwym aminokwasie następuje mała, elastyczna reszta, taka jak glicyna , której niska zawada przestrzenna pozostawia grupę peptydową otwartą na atak. Reakcje deamidacji przebiegają również znacznie szybciej przy podwyższonym pH (>10) i temperaturze .
Endoproteaza, Glu-C, wykazała specyficzność tylko wobec kwasu glutaminowego w określonych warunkach pH (4,5 i 8,0) i rozszczepiała C-końcową stronę w roztworze z Tris-HCl, wodorowęglanem lub octanem.
Zobacz też
- Clarke, S (1987). „Skłonność do spontanicznego tworzenia sukcynoimidu z reszt aspartylowych i asparaginylowych w białkach komórkowych”. Int. J., Peptide Protein Res . 30 : 808–821. PMID 3440704 .
- Stephensona, RC; Clarke, S (1989). „Tworzenie sukcynoimidu z peptydów aspartylowych i asparaginylowych jako model spontanicznej degradacji białek”. J. Biol. chemia . 264 : 6164–6170. PMID 2703484 .
- Robinson NE, Robinson AB. (2004) Zegary molekularne: deamidacja reszt asparaginylowych i glutaminylowych w peptydach i białkach. Althouse Press: Cave Junction, Ore. OCLC 56978028