cytrulinacja
Cytrulinacja lub deiminacja to konwersja aminokwasu argininy w białku do aminokwasu cytruliny . Cytrulina nie jest jednym z 20 standardowych aminokwasów kodowanych przez DNA w kodzie genetycznym . Zamiast tego jest wynikiem modyfikacji potranslacyjnej . Cytrulinacja różni się od tworzenia wolnego aminokwasu cytruliny w ramach cyklu mocznikowego lub jako produkt uboczny enzymów z rodziny syntaz tlenku azotu .
Enzymy zwane deiminazami argininowymi (ADI) katalizują deiminację wolnej argininy, podczas gdy białkowe deiminazy argininowe lub deiminazy peptydyloargininowe (PAD) zastępują pierwszorzędową grupę ketiminową (>C=NH) grupą ketonową (>C=O). Arginina jest naładowana dodatnio w neutralnym pH, podczas gdy cytrulina nie ma ładunku wypadkowego. Zwiększa to hydrofobowość białka, co może prowadzić do zmian w fałdowaniu białka , wpływając na jego strukturę i funkcję.
Układ odpornościowy może atakować cytrulinowane białka, prowadząc do chorób autoimmunologicznych, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów (RA) i stwardnienie rozsiane (MS). Fibryna i fibrynogen mogą być preferowanymi miejscami deiminacji argininy w stawach reumatoidalnych. Test na obecność przeciwciał przeciwko cytrulinowanemu białku (ACP) jest wysoce swoisty (88–96%) dla reumatoidalnego zapalenia stawów, mniej więcej tak samo czuły jak czynnik reumatoidalny (70–78%) w diagnostyce RZS i jest wykrywalny nawet przed początkiem choroby klinicznej.
Cytrulinowana wimentyna może być autoantygenem w RZS i innych chorobach autoimmunologicznych i jest używana do badania RZS. Ponadto przeciwciała przeciwko zmutowanej cytrulinowanej wimentynie (MCV) mogą być przydatne w monitorowaniu efektów terapii RZS. System ELISA wykorzystuje genetycznie zmodyfikowaną cytrulinowaną wimentynę (MCV), naturalnie występującą izoformę wimentyny, aby poprawić wydajność testu.
W reakcji z argininy na cytrulinę jeden z końcowych atomów azotu łańcucha bocznego argininy zostaje zastąpiony atomem tlenu . W ten sposób ładunek dodatni argininy (przy fizjologicznym pH) jest usuwany, zmieniając trzeciorzędową strukturę białka . Reakcja wykorzystuje jedną wody i daje amoniak jako produkt uboczny:
podtypy PAD
PAD występują u strunowców, ale nie u zwierząt niższych. U ssaków znaleziono pięć izotypów PAD – PAD1 , PAD2 , PAD3 , PAD4 i PAD6. Uważano, że PAD5 jest unikalnym izotypem u ludzi, jednak wykazano, że jest homologiczny do PAD4. Izotypy te różnią się rozmieszczeniem w tkankach i komórkach.
Ekspresję PAD1 wykryto w naskórku i macicy i działa ona w cytrulinacji keratyny i filagryny , kluczowych składników keratynocytów .
PAD2 ulega ekspresji na wysokim poziomie w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN), w tym w oku i mózgu, a także w mięśniach szkieletowych i śledzionie. Transkrypty PAD znaleziono w oczach myszy C57BL6/J już w dniu embrionalnym 14,5. Wykazano również, że PAD2 oddziałuje z wimentyną w mięśniach szkieletowych i makrofagach, powodując rozpad włókien, co sugeruje rolę w apoptozie .
Jednym z docelowych substratów PAD2 jest zasadowe białko mieliny (MBP). W normalnej siatkówce deiminacja występuje w prawie wszystkich warstwach siatkówki, w tym w fotoreceptorach . Deiminacja została również opisana w komórkach neuronalnych, takich jak astrocyty , mikroglej i oligodendrocyty , komórki Schwanna i neurony . Metylacja i fosforylacja MBP są aktywne podczas procesu mielinogenezy . We wczesnym rozwoju OUN zarodka deiminacja MBP odgrywa główną rolę w składaniu mieliny. U dorosłych deiminacja MBP występuje w chorobach demielinizacyjnych, takich jak stwardnienie rozsiane. MBP może w każdym przypadku wpływać na różne typy komórek.
Ekspresja PAD3 została powiązana z modyfikacją wełny owczej. Cytrulinacja trichohyaliny pozwala jej wiązać i sieciować włókna keratynowe, kierując wzrostem włókna wełny.
PAD4 reguluje ekspresję genów poprzez modyfikacje histonów . DNA jest owinięte wokół histonów, a białka histonowe mogą kontrolować ekspresję DNA, gdy dodaje się i usuwa grupy chemiczne. Proces ten jest znany jako przetwarzanie potranslacyjne lub modyfikacja potranslacyjna, ponieważ zachodzi na białku po translacji DNA. Rola przetwarzania potranslacyjnego w regulacji genów jest przedmiotem rozwijającej się dziedziny badań, epigenetyki . Jednym z mechanizmów modyfikacji jest metylacja . Grupa metylowa (CH 3 ) wiąże się z argininą na białku histonowym, zmieniając wiązanie DNA z histonem i umożliwiając zajście transkrypcji. Kiedy PAD przekształca argininę w cytrulinę na histonie, blokuje dalszą metylację histonu, hamując transkrypcję. Głównym izotypem tego jest PAD4, który deiminuje argininy i/lub monometylowane argininy na histonach 3 i 4, wyłączając efekty metylacji argininy.
Choroby autoimmunologiczne
W reumatoidalnym zapaleniu stawów i innych chorobach autoimmunologicznych, takich jak łuszczycowe zapalenie stawów , toczeń rumieniowaty układowy i zespół Sjögrena , autoprzeciwciała często atakują cytrulinowane białka. Obecność przeciwciał przeciwko cytrulinowanemu białku jest standardowym testem na reumatoidalne zapalenie stawów i wiąże się z cięższym przebiegiem choroby. Cytrulinowane białka znajdują się również w resztkach komórkowych towarzyszących niszczeniu komórek w chorobie Alzheimera oraz po paleniu papierosów. Tak więc cytrulinacja wydaje się być częścią mechanizmu stymulującego układ odpornościowy w chorobie autoimmunologicznej. Jednak cytrulinowane białka można również znaleźć w zdrowej błonie śluzowej okrężnicy .
Pierwszy kompleksowy podręcznik dotyczący deiminacji został opublikowany w 2014 roku.
Wykrywanie cytrulinowanych peptydów i białek
Cytrulinowane peptydy i białka można wykrywać za pomocą przeciwciał ukierunkowanych na cytrulinowane reszty lub wykrywać za pomocą technologii proteomicznych opartych na spektrometrii mas . Cytrulinacja argininy powoduje wzrost masy monoizotopowej o +0,984016 Da, co można zmierzyć za pomocą spektrometrii mas . Przesunięcie masy jest zbliżone do różnicy mas między różnymi izotopami peptydów wynoszącej +1,008665, co można pomylić z cytrulinowanym peptydem, zwłaszcza na instrumentach o niskiej rozdzielczości. Jest to jednak mniejszy problem w przypadku nowoczesnych spektrometrów mas o wysokiej rozdzielczości/wysokiej dokładności. Ponadto przesunięcie masy jest identyczne z przesunięciem masy spowodowanym dezamidacją łańcucha bocznego aminokwasu asparaginy lub glutaminy, które są powszechnymi modyfikacjami .
Reszty cytruliny mogą być chemicznie modyfikowane butanodionem lub przez biotynylację przed analizą, co prowadzi do innego przesunięcia masy, a strategia ta została z powodzeniem wykorzystana do ułatwienia identyfikacji za pomocą spektrometrii mas .
Innym podejściem jest wykorzystanie neutralnej utraty kwasu izocyjanowego (HNCO) z reszt cytruliny po poddaniu fragmentacji dysocjacyjnej wywołanej kolizją o niskiej energii w spektrometrach mas. Utrata powoduje przesunięcie masy o -43,0058 Da, które może być wykorzystane przez spektrometry masowe do głównie selekcji cytrulinowanych peptydów do fragmentacji (sekwencjonowania).
Wreszcie można wykorzystać utratę ładunku dodatniego przy fizjologicznym pH spowodowaną cytrulinacją. Przed oddolną analizą proteomiczną białka są rozszczepiane enzymatycznie na peptydy. Powszechnie proteaza trypsyna , która rozszczepia po dodatnio naładowanych resztach argininy i lizyny . Jednak trypsyna nie jest w stanie rozszczepić się po reszcie cytruliny, która jest obojętna. Pominięte rozszczepienie po reszcie cytruliny wraz z prawidłowym przesunięciem masy można wykorzystać jako specyficzny i czuły marker cytrulinacji, a strategia jest kompatybilna ze standardowymi przepływami pracy proteomiki oddolnej .