adenylacja
Adenylacja , bardziej znana jako AMPylacja , to proces, w którym cząsteczka monofosforanu adenozyny (AMP) jest kowalencyjnie przyłączana do bocznego łańcucha aminokwasu białka . To kowalencyjne dodanie AMP do hydroksylowego łańcucha bocznego białka jest modyfikacją potranslacyjną . Adenylacja obejmuje wiązanie fosfodiestrowe między grupą hydroksylową cząsteczki ulegającej adenylacji a grupą fosforanową nukleotydu monofosforanu adenozyny ( tj. kwasu adenylowego). Enzymy które są zdolne do katalizowania tego procesu, nazywane są AMPylatorami.
Znanymi aminokwasami, które mają być celem w białku, są tyrozyna i treonina, a czasami seryna. Kiedy ładunki na białku ulegają zmianie, wpływa to na właściwości białka, zwykle poprzez zmianę jego kształtu poprzez interakcje aminokwasów, które tworzą białko. AMPylacja może mieć różny wpływ na białko. Są to właściwości białka, takie jak stabilność, aktywność enzymatyczna, wiązanie kofaktora i wiele innych możliwości funkcjonalnych białka. Inną funkcją adenylacji jest aktywacja aminokwasów, która jest katalizowana przez syntetazę aminoacylową tRNA. Najczęściej identyfikowanymi białkami, które otrzymują AMPylację, są GTPazy i syntetaza glutaminy .
adenylatory
Enzymy odpowiedzialne za AMPylację, zwane AMPylatorami lub adenylotransferazą , dzielą się na dwie różne rodziny, wszystkie w zależności od ich właściwości strukturalnych i zastosowanego mechanizmu. AMPylator jest tworzony przez dwie homologiczne połówki katalityczne. Jedna połowa jest odpowiedzialna za katalizowanie reakcji adenylacji, podczas gdy druga połowa katalizuje reakcję fosforolitycznego deadenylowania . Te dwie rodziny to DNA- β -polimerazopodobne i rodzina Fic.
DNA- β- polimerazy, jest rodziną nukleotydylotransferazy . Dokładniej jest znany jako rodzina GlnE. Istnieje specyficzny motyw, który jest używany do wyjaśnienia tej konkretnej rodziny. Motyw składa się z trójniciowego arkusza β, który jest częścią koordynacji jonów magnezu i wiązania fosforanów. Asparaginian jest niezbędny do aktywności w tej rodzinie.
Domena Fic należy do nadrodziny Fido (Fic/Doc) Rodzina Fic , która jest filamentacją indukowaną przez cykliczną domenę AMP, jest znana z przeprowadzania AMPylacji. Ta rodzina białek występuje we wszystkich dziedzinach życia na ziemi. Pośredniczy w tym mechanizm motywu helisy alfa w miejscu wiązania ATP. Bakterie zakaźne wykorzystują tę domenę do przerwania fagocytozy i spowodowania śmierci komórki. Domeny Fic to konserwowane ewolucyjnie domeny u prokariotów i eukariotów , które należą do nadrodziny domen Fido.
Wykazano, że AMPylatory są porównywalne z kinazami ze względu na ich aktywność hydrolizy ATP i odwracalne przeniesienie metabolitu do hydroksylowego łańcucha bocznego substratu białkowego. Jednak AMPylacja katalizuje atak nukleofilowy na grupę α-fosforanową, podczas gdy kinaza w reakcji fosforylacji celuje w γ-fosforan. Nukleofilowy atak AMPylacji prowadzi do uwolnienia pirofosforanu, a białko zmodyfikowane AMP jest produktem reakcji AMPylacji.
De-adenylatory
De-AMPylacja to reakcja odwrotna, w której cząsteczka AMP jest odłączana od aminokwasowej strony białka łańcuchowego.
Istnieją trzy znane mechanizmy tej reakcji. Bakteryjna GS-ATaza (GlnE) koduje dwudzielne białko z oddzielnymi domenami N-końcowej AMPylacji i C-końcowej de-AMPylacji, których aktywność jest regulowana przez PII i związane z nią modyfikacje potranslacyjne. De-AMPylacja jego substratu AMPylowana syntetaza glutaminy przebiega przez reakcję fosforolityczną między adenylo-tyrozyną GS i ortofosforanem , prowadzącą do powstania ADP i niezmodyfikowanej syntetazy glutaminy.
SidD, białko wprowadzone do komórki gospodarza przez patogenną bakterię Legionella pneumophila , de-AMPylates Rab1, białko gospodarza AMPylowane przez inny enzym Legionella pneumophila , AMPylazę SidM. Podczas gdy korzyść dla patogenu z wprowadzenia tych dwóch antagonistycznych efektorów do gospodarza pozostaje niejasna, reakcja biochemiczna przeprowadzana przez SidD obejmuje użycie domeny podobnej do fosfatazy do katalizowania hydrolitycznego usuwania AMP z tyrozyny 77 Rab1 gospodarza.
W komórkach zwierzęcych usuwanie AMP z treoniny 518 BiP/Grp78 jest katalizowane przez ten sam enzym FICD, który AMPyluje BiP. W przeciwieństwie do bakteryjnej GS-ATazy, FICD przeprowadza obie reakcje z tą samą domeną katalityczną.
Prokariotyczny
Homeostaza bakteryjna
AMPylacja bierze udział w homeostazie bakterii. Najbardziej znanym przykładem jest AMPylator GS-ATaza (GlnE), która bierze udział w złożonej regulacji metabolizmu azotu poprzez AMPylację syntetazy glutaminy, która została wprowadzona w częściach AMPylation i DeAMPylation.
Innym przykładem AMPylatorów, które odgrywają rolę w homeostazie bakteryjnej, są AMPylatory Fic klasy I (FicT), które modyfikują podjednostkę GyrB gyrazy DNA, konserwowaną resztę tyrozynową do wiązania ATP podjednostki ParE w topoizomerazie IV. Ta inaktywacja gyrazy DNA przez AMPylację prowadzi do aktywacji odpowiedzi SOS, która jest odpowiedzią komórkową na uszkodzenie DNA. Aktywność FicT AMPylation jest odwracalna i prowadzi jedynie do zatrzymania wzrostu, ale nie do śmierci komórki. Dlatego AMPylacja FicT odgrywa rolę w regulacji stresu komórkowego, co u bakterii Wolbachia pokazuje, że poziom FicT wzrasta w odpowiedzi na doksycyklinę.
Stwierdzono również, że Fic AMPylator NmFic klasy III N. meningtidis modyfikuje AMPylate GyrB w konserwowanej tyrozynie do wiązania ATP. To pokazuje, że domeny Fic są wysoce konserwatywne, co wskazuje na ważną rolę AMPylacji w regulacji stresu komórkowego u bakterii. Regulacja NmFic obejmuje zależną od stężenia monomeryzację i autoAMPylację w celu aktywacji aktywności NmFic.
Patogeniczność bakteryjna
Wykazano, że białka bakteryjne, znane również jako efektory, wykorzystują AMPylację. Wykazano, że efektory, takie jak VopS, IbpA i DrrA, AMPylate GTPazy gospodarza i powodują zmiany w cytoszkielecie aktynowym. GTPazy są częstymi celami AMPylatorów. Rodziny GTPazy Rho , Rab i Arf są zaangażowane w dynamikę cytoszkieletu aktynowego i handel pęcherzykami. Odgrywają również role w mechanizmach kontroli komórkowej, takich jak fagocytoza w komórce gospodarza.
Patogen wzmacnia lub zapobiega swojej internalizacji poprzez indukowanie lub hamowanie fagocytozy komórek gospodarza . Vibrio parahaemolyticus to Gram-ujemna bakteria, która powoduje zatrucia pokarmowe w wyniku spożycia surowych lub niedogotowanych owoców morza u ludzi. VopS, efektor typu III występujący w Vibrio parahaemolyticus , zawiera domenę Fic, która ma konserwatywny motyw HPFx(D/E)GN(G/K)R, który zawiera resztę histydyny niezbędną do AMPylacji. VopS blokuje montaż aktyny poprzez modyfikację reszty treoniny w regionie przełącznika 1 GTPaz Rho. Przeniesienie ugrupowania AMP za pomocą ATP do reszty treoniny powoduje zawadę steryczną, a tym samym zapobiega oddziaływaniu GTPaz Rho z efektorami w dół. VopS adenyluje również RhoA i cykl podziału komórki 42 (CDC42), co prowadzi do dezagregacji sieci włókien aktynowych. W rezultacie kontrola cytoszkieletu aktynowego komórki gospodarza jest wyłączona, co prowadzi do zaokrąglenia komórek.
IbpA jest wydzielany do komórek eukariotycznych przez H. somni , Gram-ujemną bakterię bydła, która powoduje infekcję nabłonka dróg oddechowych. Ten efektor zawiera dwie domeny Fic w regionie C-końcowym. Za jego cytotoksyczność odpowiada AMPylacja domeny IbpA Fic GTPaz rodziny Rho. Obie domeny Fic mają podobny wpływ na cytoszkielet komórek gospodarza jak VopS. AMPylacja na reszcie tyrozynowej regionu przełącznika 1 blokuje interakcję GTPaz z substratami w dół, takimi jak PAK.
DrrA jest substratem systemu translokacji Dot/Icm typu IV DrrA z Legionella pneumophila . Jest to efektor wydzielany przez L. pneumophila w celu modyfikacji GTPaz komórek gospodarza. Ta modyfikacja zwiększa przeżywalność bakterii w komórkach gospodarza. DrrA składa się ze specyficznego czynnika wymiany nukleotydów guaninowych Rab1b (GEF), C-końcową domenę wiążącą lipidy i domenę N-końcową o niejasnych właściwościach cytotoksycznych. Prace badawcze pokazują, że N-końcowa i pełnej długości DrrA wykazuje aktywność AMPylatorów w stosunku do białka Rab1b gospodarza (białka pokrewnego Ras), które jest również substratem domeny Rab1b GEF. Białko Rab1b jest GTPazą Rab regulującą transport pęcherzyków i fuzję błon. Adenylacja przez bakterie AMPylatory przedłuża stan Rab1b związany z GTP. Tak więc rola efektora DrrA jest związana z korzyściami płynącymi z wakuoli bakterii dla ich replikacji podczas infekcji.
eukariotyczny
Rośliny i drożdże nie mają znanych endogennych enzymów AMPylujących, ale genomy zwierzęce są wyposażone w pojedynczą kopię genu kodującego AMPylazę domeny Fic, która prawdopodobnie została nabyta przez wczesnego przodka zwierząt poprzez poziomy transfer genów od prokariota . Białko ludzkie, powszechnie określane jako FICD, zostało wcześniej zidentyfikowane jako białko E związane z huntingtyną (HypE; przypisanie wynikające z badania przesiewowego dwóch hybryd drożdży, ale o wątpliwym znaczeniu, ponieważ huntingtyna i HypE/FICD są zlokalizowane w różnych przedziałach komórkowych) . CG9523 Homologi u Drosophila melanogaster (CG9523) i Zwrócono również uwagę na C. elegans (Fic-1) . U wszystkich zwierząt FICD ma podobną strukturę. Jest to domeny transbłonowej typu II , z krótką domeną cytoplazmatyczną, po której następuje kotwica błonowa, która utrzymuje białko w retikulum endoplazmatycznym (ER) i długą częścią C-końcową, która znajduje się w ER i obejmuje powtórzenia tetratrikopeptydowe (TPR), po których następuje katalityczna Domena fikcyjna.
Retikulum endoplazmatyczne
Odkrycie AMPylazy z komórek zwierzęcych, a następnie odkrycie jej lokalizacji ER oraz odkrycie, że BiP jest znaczącym substratem dla jej aktywności, były ważnymi przełomami. Od dawna wiadomo , że BiP (znany również jako Grp78) przechodzi inaktywującą modyfikację potranslacyjną, ale z natury pozostaje nieuchwytny. Powszechnie przyjmuje się, że jest to rybozylacja ADP , okazuje się, że jest to AMPylacja za pośrednictwem FICD, ponieważ inaktywacja genu FICD w komórkach zniosła wszystkie mierzalne potranslacyjne modyfikacje BiP.
białkiem opiekuńczym zlokalizowanym w ER, którego aktywność jest ściśle regulowana na poziomie transkrypcji poprzez program ekspresji genów znany jako Unfolded Protein Response (UPR). UPR to homeostatyczny , który łączy szybkość transkrypcji BiP (i wielu innych białek) z obciążeniem niesfałdowanych białek w ER (tzw. stres ER), aby pomóc w utrzymaniu proteostazy ER . AMPylacja dodaje kolejną szybką potranslacyjną warstwę kontroli aktywności BiP, ponieważ modyfikacja Thr518 domeny wiążącej substrat BiP za pomocą AMP blokuje białko opiekuńcze w nieaktywnej konformacji. Ta modyfikacja jest selektywnie wdrażana, gdy stres ER słabnie, aby dezaktywować nadwyżkę BiP. Jednak gdy stres ER ponownie wzrasta, ten sam enzym, FICD, katalizuje reakcję przeciwną, de-AMPylację BiP.
Stopniowo pojawia się zrozumienie strukturalnych podstaw AMPylacji i de-AMPylacji BiP, podobnie jak wskazówki dotyczące allostery, które mogą regulować zmianę aktywności FICD, ale ważne szczegóły tego procesu zachodzącego w komórkach pozostają do odkrycia.
Rola FICD w AMPylacji BiP (i de-AMPylacji) na Thr518 jest dobrze poparta badaniami biochemicznymi i strukturalnymi. Przedstawiono również dowody na to, że w pewnych okolicznościach FICD może AMPylować inną resztę, Thr366 w domenie wiążącej nukleotydy BiP.
Caenorhabditis elegans
Fic-1 jest jedynym białkiem Fic obecnym w kodzie genetycznym C. elegans . Występuje głównie w otoczce jądrowej ER dorosłych komórek płciowych i komórek embrionalnych, ale niewielkie ilości można znaleźć w cytoplazmie. Tej dodatkowej puli ER FICD-1 przypisuje się AMPylację histonów rdzeniowych i czynniki translacji typu eEF1-A w obrębie nicienia.
Chociaż różne poziomy AMPylacji nie powodowały żadnych zauważalnych efektów w zachowaniu lub fizjologii nicieni, robaki z nokautem Fic-1 były bardziej podatne na infekcję przez Pseudomonas aeruginosa w porównaniu z odpowiednikami z aktywnymi domenami Fic-1, co sugeruje związek między AMPylacją celów komórkowych i odpowiedzi immunologiczne u nicieni.
muszka owocowa
Muchy pozbawione FICD (CG9523) zostały opisane jako ślepe. Początkowo defekt ten przypisywano roli FICD na powierzchni komórek projekcji główkowatych - domniemanym miejscu recyklingu neuroprzekaźników, jednak późniejsze badanie wykazało, że AMPylacja BiP Thr366 za pośrednictwem FICD dotyczy problemu wizualnego
Znaczenie kliniczne
, że presynaptyczne białko α-synukleina jest celem AMPylacji FICD. Podczas adenylacji αSyn za pośrednictwem HypE agregacja αSyn zmniejsza się i odkryto, że zarówno neurotoksyczność, jak i stres ER zmniejszają się in vitro . Zatem adenylacja αSyn jest prawdopodobnie odpowiedzią ochronną na stres ER i agregację αSyn. Ponieważ jednak aSyn i FICD znajdują się w różnych przedziałach, należy przeprowadzić dalsze badania potwierdzające znaczenie tych twierdzeń.
Wykrycie
Uchwyty chemiczne
Uchwyty chemiczne służą do wykrywania białek zmodyfikowanych potranslacyjnie. Ostatnio istnieje N6pATP, który zawiera znacznik alkinylowy (propargyl) w pozycji N6 adeniny ATP. Ten N6pATP łączy się z reakcją kliknięcia w celu wykrycia AMPylowanych białek. Do wykrywania nierozpoznanych zmodyfikowanych białek i znakowania substratów VopS wykorzystuje się pochodne ATP z fluoroforem w adeninie N6 NH2.
Metoda oparta na przeciwciałach
Przeciwciało słynie z wysokiego powinowactwa i selektywności, więc jest dobrym sposobem na wykrycie AMPylowanych białek. Ostatnio przeciwciała ɑ-AMP są wykorzystywane do bezpośredniego wykrywania i izolowania AMPylowanych białek (zwłaszcza AMPylowanej tyrozyny i AMPylowanej treoniny) z komórek i lizatów komórkowych. AMPylacja jest modyfikacją potranslacyjną, więc będzie modyfikować właściwości białek, nadając AMP polarny charakter i hydrofobowość. Tak więc, zamiast stosowania przeciwciał, które wykrywają całą sekwencję peptydową, korzystne są przeciwciała skierowane bezpośrednio na określone aminokwasy AMP.
Spekrtometria masy
Wcześniej wiele prac naukowych wykorzystywało spektrometrię mas (MS) w różnych trybach fragmentacji do wykrywania peptydów AMPylowanych. W odpowiedzi na charakterystyczne techniki fragmentacji, AMPylowane sekwencje białkowe rozpadały się w różnych częściach AMP. Podczas gdy dysocjacja z przeniesieniem elektronu (ETD) tworzy minimalne fragmenty i mniej skomplikowane widma, dysocjacja wywołana kolizją (CID) i fragmentacja zderzeń wysokoenergetycznych (HCD) generują charakterystyczne jony odpowiednie do identyfikacji AMPylowanych białek poprzez generowanie wielu fragmentów AMP. Ze względu na stabilność AMP widma fragmentacji peptydów można łatwo odczytać ręcznie lub za pomocą wyszukiwarek.
Inhibitory
Odkryto inhibitory AMPylacji białek o stałej hamowania (Ki ) w zakresie od 6 do 50 µM i co najmniej 30-krotnej selektywności względem HypE.