GCaMP
GCaMP jest genetycznie kodowanym wskaźnikiem wapnia (GECI), opracowanym w 2001 roku przez Junichi Nakai. Jest to syntetyczna fuzja zielonego białka fluorescencyjnego (GFP), kalmoduliny (CaM) i M13, sekwencji peptydowej kinazy lekkiego łańcucha miozyny . Po związaniu z Ca2 + , GCaMP fluoryzuje na zielono z długością fali szczytu wzbudzenia 480 nm i długości fali szczytu emisji 510 nm. Jest stosowany w badaniach biologicznych do pomiaru wewnątrzkomórkowego poziomu Ca 2+ zarówno in vitro, jak i in vivo przy użyciu transfekowanych wirusowo lub transgenicznych linii komórkowych i zwierzęcych. Sekwencję genetyczną kodującą GCaMP można wstawić pod kontrolą promotorów występujących wyłącznie w określonych typach komórek, co pozwala na ekspresję GCaMP specyficzną dla typu komórki. Ponieważ Ca 2+ jest drugim przekaźnikiem , który bierze udział w wielu mechanizmach komórkowych i szlakach sygnałowych , GCaMP umożliwia naukowcom ilościowe określenie aktywności mechanizmów opartych na Ca 2+ i zbadanie roli Ca 2+ jony w interesujących nas procesach biologicznych.
Struktura
GCaMP składa się z trzech kluczowych domen: domeny M13 na N-końcu , domeny kalmoduliny (CaM) na C-końcu i domeny GFP w środku. Domena GFP jest permutowana kołowo , tak że natywne N- i C-końce są połączone ze sobą sześcioaminokwasową sekwencją łączącą, a sekwencja GFP jest podzielona w środku, tworząc nowe N- i C-końce, które łączą się z domeny M13 i CaM.
Pod nieobecność Ca 2+ chromofor GFP jest wystawiony na działanie wody i istnieje w stanie protonowanym z minimalną intensywnością fluorescencji. Po związaniu Ca 2+ domena CaM przechodzi zmianę konformacyjną i ściśle wiąże się z helisą alfa domeny M13 , uniemożliwiając cząsteczkom wody dostęp do chromoforu. W rezultacie chromofor szybko deprotonuje i przekształca się w postać anionową, która jasno fluoryzuje, podobnie jak natywny GFP.
Historia i rozwój
W 2001 roku Nakai i in. opisali rozwój GCaMP1 jako sondy Ca2 + o poprawionym stosunku sygnału do szumu w porównaniu z wcześniej opracowanymi sondami fluorescencyjnymi Ca2 + . Pierwsza transgeniczna mysz wykazująca ekspresję GCaMP1 została opisana w 2004 r. Jednak w temperaturze 37˚C (temperatura fizjologiczna u ssaków) GCaMP1 nie fałdował się stabilnie ani nie fluoryzował, co ogranicza jego potencjalne zastosowanie jako wskaźnika wapnia in vivo.
W 2006 roku Tallini i in. następnie donieśli o poprawie GCaMP1 do GCaMP2, który wykazywał jaśniejszą fluorescencję niż GCaMP1 i większą stabilność w ssaków . Tallini i in. eksprymował GCaMP2 w kardiomiocytach zarodków myszy, aby przeprowadzić pierwsze obrazowanie Ca 2+ in vivo GCaMP u ssaków.
Dalsze modyfikacje GCaMP, w tym GCaMP3, GCaMP5, GCaMP6 i jGCaMP7, zostały opracowane w celu stopniowej poprawy sygnału, czułości i zakresu dynamicznego wykrywania Ca2 + , przy czym najnowsze wersje wykazują fluorescencję podobną do natywnego GFP.
Warianty w użyciu
Zarówno wolne warianty (GCaMP6s, jGCaMP7s), jak i szybkie warianty (GCaMP6f, jGCaMP7f) są wykorzystywane w badaniach biologicznych i neurologicznych . Powolne warianty są jaśniejsze i bardziej wrażliwe na niewielkie zmiany poziomów Ca 2+ , takie jak pojedyncze potencjały czynnościowe ; z drugiej strony szybkie warianty są mniej czułe, ale reagują szybciej, co czyni je przydatnymi do śledzenia zmian w Ca 2+ poziomy w precyzyjnych ramach czasowych. GCaMP6 ma również średni wariant, GCaMP6m, którego kinetyka jest pośrednia między GCaMP6 a GCaMP6f. Stosowane są również inne warianty jGCaMP7: jGCaMP7b wykazuje jasną podstawową fluorescencję i jest używany do obrazowania dendrytów i aksonów , podczas gdy jGCaMP7c wykazuje większy kontrast między maksymalną i podstawową fluorescencją i jest korzystny do obrazowania dużych populacji neuronów.
W 2018 roku Yang i in. donieśli o rozwoju GCaMP-X, wygenerowanego przez dodanie motywu wiążącego kalmodulinę. Ponieważ domena kalmoduliny GCaMP, gdy jest niezwiązana, zakłóca kanału wapniowego typu L , dodany motyw wiązania kalmoduliny zapobiega zakłócaniu przez GCaMP-X mechanizmów sygnalizacji zależnych od wapnia.
W 2020 roku Zhang i in. opisali rozwój jGCaMP8, w tym wariantów wrażliwych, średnich i szybkich, które wykazują szybszą kinetykę i większą czułość niż odpowiadające im warianty jGCaMP7.
Opracowano również wskaźniki czerwonej fluorescencji: jRCaMP1a i jRCaMP1b wykorzystują permutację kołową czerwonego białka fluorescencyjnego mRuby zamiast GFP, podczas gdy jRGECO1a jest oparty na czerwonym białku fluorescencyjnym mApple. Ponieważ niebieskie światło używane do wzbudzania GCaMP jest rozpraszane przez tkanki, a emitowane zielone światło jest absorbowane przez krew, czerwone wskaźniki fluorescencyjne zapewniają większą penetrację i głębię obrazowania in vivo niż GCaMP. Zastosowanie czerwonych wskaźników fluorescencyjnych pozwala również uniknąć fotouszkodzeń powodowanych przez niebieskie światło wzbudzające. Ponadto czerwone wskaźniki fluorescencyjne pozwalają na jednoczesne zastosowanie optogenetyki , co jest trudne w przypadku GCaMP, ponieważ długości fal wzbudzenia GCaMP pokrywają się z tymi dla kanałowej rodopsyny-2 (ChR2). Jednoczesne użycie czerwonych i zielonych GECI może zapewnić dwukolorową wizualizację różnych regionów subkomórkowych lub populacji komórek.
Zastosowania w badaniach
Aktywność neuronalna
W neuronach potencjały czynnościowe indukują uwalnianie neuroprzekaźników na zakończeniach aksonów poprzez otwieranie kanałów Ca 2+ bramkowanych napięciem , umożliwiając napływ Ca 2+ . W rezultacie GCaMP jest powszechnie stosowany do pomiaru wzrostu wewnątrzkomórkowego Ca 2+ w neuronach jako wskaźnik aktywności neuronalnej w wielu modelach zwierzęcych, w tym Caenorhabditis elegans , danio pręgowanego , Drosophila i myszy . Ostatnio zakodowane genetycznie wskaźniki napięcia (GEVI) zostały opracowane wraz z GECI, aby bardziej bezpośrednio badać aktywność neuronów na poziomie komórkowym w tych modelach zwierzęcych.
GCaMP odegrał kluczową rolę w tworzeniu wielkoskalowych nagrań neuronowych u zwierząt w celu zbadania, w jaki sposób wzorce aktywności w sieciach neuronowych wpływają na zachowanie. Na przykład Nguyen i in. (2016) wykorzystali GCaMP w obrazowaniu całego mózgu podczas swobodnego ruchu C. elegans do identyfikacji neuronów i grup neuronów, których aktywność korelowała z określonymi zachowaniami lokomotorycznymi.
Muto i in. (2003) wyrażali GCaMP w zarodkach danio pręgowanego w celu pomiaru i mapowania skoordynowanej aktywności neuronów ruchowych rdzenia kręgowego w różnych częściach mózgu podczas początku, rozprzestrzeniania się i powrotu do zdrowia napadów wywołanych pentylenotetrazolem . Ekspresja GCaMP w mózgach danio pręgowanego została również wykorzystana do badania aktywacji obwodów neuronalnych w procesach poznawczych, takich jak chwytanie zdobyczy, kontrola impulsów i uwaga.
Ponadto naukowcy wykorzystali GCaMP do obserwacji aktywności neuronalnej u myszy poprzez jej ekspresję pod kontrolą promotora Thy1 , który znajduje się w pobudzających neuronach piramidalnych . Na przykład integracja neuronów w obwody podczas uczenia się motorycznego była śledzona za pomocą GCaMP do obserwacji zsynchronizowanych wzorców fluktuacji poziomów Ca 2+ . GCaMP był również używany do obserwacji dynamiki Ca 2+ w przedziałach subkomórkowych neuronów myszy: Cichon i Gan (2015) wykorzystali GCaMP do wykazania, że neurony w korze ruchowej myszy wykazują NMDA wzrost Ca2 + , który jest niezależny dla każdego kolca dendrytycznego , pokazuje w ten sposób, że poszczególne kolce dendrytyczne regulują plastyczność synaptyczną . Wreszcie GCaMP został wykorzystany do identyfikacji wzorców aktywności w określonych regionach mózgu myszy. Na przykład Jones i in. (2018) wykorzystali GCaMP6 u myszy do pomiaru aktywności neuronów w jądrze nadskrzyżowaniowym (SCN), stymulatorze okołodobowym ssaków , i wykazali, że neurony SCN, które wytwarzały wazoaktywny peptyd jelitowy (VIP), wykazywały dzienny rytm aktywności in vivo , które korelowały z uwalnianiem VIP.
GCaMP połączono również z fotometrią światłowodową w celu pomiaru zmian Ca 2+ na poziomie populacji w subpopulacjach neuronów swobodnie poruszających się zwierząt. Na przykład Clarkson i in. (2017) wykorzystali tę metodę, aby wykazać, że neurony w jądrze łukowatym podwzgórza synchronizują się ze wzrostem Ca 2+ bezpośrednio przed impulsami hormonu luteinizującego (LH). Chociaż obrazowanie GCaMP za pomocą fotometrii światłowodowej nie może śledzić zmian poziomów Ca 2+ w poszczególnych neuronach, zapewnia większe rozdzielczość czasowa dla zmian na dużą skalę.
Przewodnictwo sercowe
Prądy Ca 2+ przez złącza szczelinowe kardiomiocytów pośredniczą w zsynchronizowanym skurczu tkanki serca. W rezultacie ekspresję GCaMP w kardiomiocytach, zarówno in vitro , jak i in vivo , wykorzystano do badania pobudzenia i skurczu zależnego od napływu Ca 2+ u danio pręgowanego i myszy. Na przykład Tallini i in. (2006) eksprymowali GCaMP2 w embrionach myszy, aby wykazać, że w dniu embrionalnym 10.5 przewodnictwo elektryczne było szybkie w przedsionkach i komorach , ale powolne w kanał przedsionkowo-komorowy . Chi i in. (2008) wykorzystali transgeniczną, specyficzną dla serca linię danio pręgowanego GCaMP, aby zobrazować aktywację kardiomiocytów w całym cyklu pracy serca; na podstawie swoich wyników scharakteryzowali cztery etapy rozwojowe układu przewodzącego serca danio pręgowanego i zidentyfikowali 17 nowych mutacji wpływających na przewodzenie serca. Jednak niekontrolowana ekspresja GCaMP prowadzi do przerostu mięśnia sercowego z powodu nadekspresji motywu kalmoduliny, który zakłóca wewnątrzkomórkową sygnalizację wapniową. W rezultacie eksperymenty z wykorzystaniem tkanki serca powinny dokładnie kontrolować poziom ekspresji GCaMP.
Aktywacja szlaku sygnałowego
Ponieważ Ca 2+ jest powszechnym przekaźnikiem wtórnym, GCaMP był używany do monitorowania aktywacji szlaków sygnałowych. Na przykład Bonder i McCarthy (2014) wykorzystali GCaMP do wykazania, że astrocytarnego receptora sprzężonego z białkiem G (GPCR) i późniejsze uwalnianie Ca 2+ nie były odpowiedzialne za sprzężenie nerwowo-naczyniowe, proces, w którym zmiany w aktywności neuronów prowadzą do zmian w lokalnych przepływ krwi. Podobnie Greer i Bear et al. (2016) wykorzystali GCaMP do scharakteryzowania dynamiki napływu Ca 2+ w sygnalizację neuronów węchowych naszyjnika, która wykorzystuje transbłonowe białka MS4A jako chemoreceptory .