Przeciwciało jednodomenowe

Diagram wstążkowy _domeny VHH lamy . Wydłużona pętla CDR3 jest zabarwiona na pomarańczowo.

Przeciwciało jednodomenowe ( sdAb ), znane również jako nanociało , jest fragmentem przeciwciała składającym się z pojedynczej monomerycznej zmiennej domeny przeciwciała . Podobnie jak całe przeciwciało, jest zdolne do selektywnego wiązania się z określonym antygenem . Przy masie cząsteczkowej zaledwie 12-15 kDa przeciwciała jednodomenowe są znacznie mniejsze niż zwykłe przeciwciała (150-160 kDa), które składają się z dwóch łańcuchów ciężkich białek i dwóch łańcuchów lekkich , a nawet mniejsze niż fragmenty Fab (~50 kDa, jeden łańcuch lekki i połowa łańcucha ciężkiego) i jednołańcuchowe fragmenty zmienne (~25 kDa, dwie domeny zmienne, jedna z łańcucha lekkiego i jedna z łańcucha ciężkiego).

Pierwsze przeciwciała jednodomenowe skonstruowano z przeciwciał ciężkołańcuchowych znalezionych u wielbłądowatych ; są to tak _zwane fragmenty VHH . Ryby chrzęstne mają również przeciwciała ciężkołańcuchowe (IgNAR, „receptor nowego antygenu immunoglobuliny”), z których można uzyskać przeciwciała jednodomenowe zwane fragmentami V _{NAR .} Alternatywnym podejściem jest rozdzielenie dimerycznych domen zmiennych ze wspólnej immunoglobuliny G (IgG) od ludzi lub myszy do monomerów. Chociaż większość badań nad przeciwciałami jednodomenowymi opiera się obecnie na domenach zmiennych łańcucha ciężkiego, wykazano również, że nanociała pochodzące z łańcuchów lekkich wiążą się specyficznie z docelowymi epitopami .

Wykazano, że nanociała wielbłądowatych są tak samo specyficzne jak przeciwciała, aw niektórych przypadkach są bardziej wytrzymałe. Można je łatwo wyizolować przy użyciu tej samej procedury przeszukiwania fagów, co w przypadku przeciwciał, co pozwala na ich hodowlę in vitro w dużych stężeniach. Mniejszy rozmiar i pojedyncza domena sprawiają, że te przeciwciała są łatwiejsze do przekształcenia w komórki bakteryjne do masowej produkcji, co czyni je idealnymi do celów badawczych.

Przeciwciała jednodomenowe są badane pod kątem wielu zastosowań farmaceutycznych i mają potencjał do zastosowania w leczeniu ostrego zespołu wieńcowego , raka , choroby Alzheimera i Covid-19 .

Nieruchomości

Przeciwciało jednodomenowe jest łańcuchem peptydowym o długości około 110 aminokwasów , zawierającym jedną domenę zmienną (VH ₎ przeciwciała ciężkołańcuchowego lub zwykłej IgG. Peptydy te mają podobne powinowactwo do antygenów jak całe przeciwciała, ale są bardziej odporne na ciepło i stabilne w stosunku do detergentów i wysokich stężeń mocznika . Te pochodzące z przeciwciał wielbłądowatych i ryb są mniej lipofilowe i lepiej rozpuszczalne w wodzie dzięki regionowi determinującemu komplementarność 3 (CDR3), która tworzy wydłużoną pętlę (w kolorze pomarańczowym na powyższym schemacie wstęgowym) pokrywającą miejsce lipofilowe, które normalnie wiąże się z łańcuchem lekkim. W przeciwieństwie do zwykłych przeciwciał, dwa z sześciu przeciwciał jednodomenowych przetrwały temperaturę 90 ° C (194 ° F) bez utraty zdolności wiązania antygenów w badaniu z 1999 roku. Stabilność wobec kwasu żołądkowego i proteaz zależy od sekwencji aminokwasów. Wykazano, że niektóre gatunki są aktywne w jelicie po podaniu doustnym, ale ich wchłanianie jest niskie z jelita hamuje rozwój ogólnoustrojowych, podawanych doustnie przeciwciał jednodomenowych.

Kompleks przeciwciała jednodomenowego i antygenu białkowego ujawnia zakopane miejsce wiązania. ( po lewej ) Pojedyncza domena rekina pielęgniarki V _{NAR w kompleksie z lizozymem (PDB 1T6V).} ( po prawej ) Humanizowany HyHEL-10 Fv w kompleksie z lizozymem (PDB 2EIZ)

Stosunkowo niska masa cząsteczkowa prowadzi do lepszej przepuszczalności w tkankach i do krótkiego okresu półtrwania w osoczu , ponieważ są one wydalane przez nerki . W przeciwieństwie do całych przeciwciał, nie wykazują one cytotoksyczności wyzwalanej przez układ dopełniacza , ponieważ brakuje im regionu Fc . sdAb pochodzące od wielbłądowatych i ryb są w stanie wiązać się z ukrytymi antygenami, które nie są dostępne dla całych przeciwciał, na przykład z miejscami aktywnymi enzymów . Wykazano, że ta właściwość wynika z ich rozszerzonej pętli CDR3, która jest w stanie penetrować takie zakopane miejsca.

Produkcja

Rekin (po lewej) i wielbłądowate (środkowe) przeciwciało ciężkołańcuchowe w porównaniu ze zwykłym przeciwciałem (po prawej). Ciężkie łańcuchy są pokazane w ciemniejszym odcieniu, lekkie łańcuchy w jaśniejszym odcieniu. VH i _VL są domenami zmiennymi _.

Z przeciwciał ciężkołańcuchowych

Przeciwciało jednodomenowe można otrzymać przez immunizację dromaderów , wielbłądów , lam , alpak lub rekinów pożądanym antygenem, a następnie izolację mRNA kodującego region zmienny (V _NAR i VH _H ) przeciwciał ciężkołańcuchowych. Biblioteki pojedynczych domen V _NAR i VH _{H prezentowane na dużych fagach} zostały utworzone z rekinów karmiących i wielbłądów jednogarbnych. Techniki przesiewowe, takie jak prezentacja na fagach i prezentacja rybosomalna pomaga zidentyfikować klony wiążące antygen. Przeciwciała jednodomenowe można humanizować do zastosowań klinicznych.

Z konwencjonalnych przeciwciał

Alternatywnie, przeciwciała jednodomenowe można wytworzyć ze zwykłej mysiej , króliczej lub ludzkiej IgG z czterema łańcuchami. Proces jest podobny i obejmuje biblioteki genów od immunizowanych lub naiwnych dawców oraz techniki prezentacji w celu identyfikacji najbardziej specyficznych antygenów. Problem z tym podejściem polega na tym, że region wiążący wspólnej IgG składa się z dwóch domen (VH _i VL ₎ , które mają tendencję do dimeryzacji lub agregacji z powodu ich lipofilowości. Monomeryzację zwykle przeprowadza się przez zastąpienie aminokwasów lipofilowych hydrofilowymi, ale często powoduje to utratę powinowactwa do antygenu. Jeśli powinowactwo może zostać zachowane, przeciwciała jednodomenowe mogą być również wytwarzane w E. coli , S. cerevisiae lub inne organizmy.

Z ludzkich przeciwciał jednodomenowych

Ludzie czasami wytwarzają przeciwciała jednodomenowe przez przypadkowe utworzenie kodonu stop w łańcuchu lekkim. Ludzkie jednodomenowe przeciwciała ukierunkowane na różne antygeny nowotworowe, w tym mezotelinę, GPC2 i GPC3, wyizolowano metodą prezentacji fagowej. Ludzkie przeciwciała jednodomenowe HN3 zostały wykorzystane do wytworzenia immunotoksyn i limfocytów T chimerycznego receptora antygenu (CAR) do leczenia raka wątroby. Blokowanie domeny wiążącej Wnt na rdzeniu białkowym GPC3 przez ludzkie przeciwciało jednodomenowe HN3 hamuje aktywację Wnt w komórkach raka wątroby.

Potencjalne aplikacje

Przeciwciała jednodomenowe pozwalają na szeroki zakres zastosowań w zastosowaniach biotechnicznych i terapeutycznych ze względu na ich niewielkie rozmiary, prostą produkcję i wysokie powinowactwo.

Biotechnologiczne i diagnostyczne

Fuzja białka fluorescencyjnego z nanociałem generuje tak zwane chromociała. Chromociała można wykorzystać do rozpoznawania i śledzenia celów w różnych przedziałach żywych komórek. Mogą zatem zwiększyć możliwości mikroskopii żywych komórek i umożliwią nowatorskie badania funkcjonalne. Sprzężenie nanociała anty- GFP z jednowartościową matrycą, zwaną GFP-nanotrap, umożliwia izolację białek fuzyjnych GFP i ich oddziałujących partnerów do dalszych analiz biochemicznych. Lokalizacja pojedynczej cząsteczki za pomocą technik obrazowania w super rozdzielczości wymaga specyficznego dostarczania fluoroforów zbliżyć się do docelowego białka. Ze względu na ich duży rozmiar użycie przeciwciał sprzężonych z barwnikami organicznymi może często prowadzić do mylącego sygnału ze względu na odległość między fluoroforem a białkiem docelowym. Fuzja barwników organicznych z nanociałami anty-GFP ukierunkowanymi na białka znakowane GFP umożliwia nanometrową rozdzielczość przestrzenną i minimalny błąd wiązania ze względu na mały rozmiar i wysokie powinowactwo. Dywidenda wielkości nanociał jest również korzystna dla korelacyjnej mikroskopii świetlno-elektronowej badanie. Bez żadnego środka zwiększającego przepuszczalność cytoplazma chemicznie utrwalonych komórek jest łatwo dostępna dla nanociał znakowanych fluoroforem. Ich mały rozmiar pozwala im również wnikać głębiej w próbki objętościowe niż zwykłe przeciwciała. Wysoka jakość ultrastrukturalna jest zachowana w tkance, którą obrazuje się pod mikroskopem fluorescencyjnym, a następnie elektronowym. Jest to szczególnie przydatne w badaniach neurologicznych, które wymagają zarówno znakowania molekularnego, jak i obrazowania za pomocą mikroskopu elektronowego.

W zastosowaniach diagnostycznych biosensorów nanociała mogą być stosowane prospektywnie jako narzędzie. Dzięki niewielkim rozmiarom mogą być gęściej sprzęgane na powierzchniach biosensorów. Oprócz ich przewagi w celowaniu w mniej dostępne epitopy, ich stabilność konformacyjna prowadzi również do większej odporności na warunki regeneracji powierzchni. Po unieruchomieniu jednodomenowych przeciwciał na powierzchniach czujników wykrywających ludzki antygen specyficzny dla prostaty (hPSA) zbadano. Nanociała przewyższały klasyczne przeciwciała w wykrywaniu klinicznie istotnych stężeń hPSA.

Aby zwiększyć prawdopodobieństwo krystalizacji docelowej cząsteczki, nanociał można użyć jako białek opiekuńczych krystalizacji . Jako białka pomocnicze mogą zmniejszać heterogeniczność konformacyjną poprzez wiązanie i stabilizację tylko podzbioru stanów konformacyjnych. Mogą również maskować powierzchnie zakłócające krystalizację, jednocześnie rozszerzając obszary, które tworzą styki kryształów.

Terapeutyczny

Nanociała do terapii fototermicznej. Nanociała, które są zdolne do wiązania antygenów nowotworowych, takich jak HER2 , są połączone z rozgałęzionymi nanocząsteczkami złota, które pochłaniają energię świetlną i wytwarzają ciepło w celu zabicia komórek nowotworowych.

Przeciwciała jednodomenowe zostały przetestowane jako nowe narzędzie terapeutyczne przeciwko wielu celom. U myszy zakażonych wirusem grypy A podtypu H5N1 nanociała skierowane przeciwko hemaglutyninie hamowały replikację wirusa H5N1 in vivo oraz zmniejszały zachorowalność i śmiertelność. Wykazano , że nanociała ukierunkowane na domenę wiążącą receptor komórkowy czynników wirulencji toksyny A i toksyny B z Clostridium difficile neutralizują efekty cytopatyczne w fibroblastach in vitro . Koniugaty nanociała rozpoznające komórki prezentujące antygen są z powodzeniem stosowane do wykrywania nowotworów lub ukierunkowanego dostarczania antygenu w celu wywołania silnej odpowiedzi immunologicznej.

Dostępne doustnie przeciwciała jednodomenowe przeciwko biegunce wywołanej przez E. coli u prosiąt zostały opracowane i pomyślnie przetestowane. Inne choroby przewodu żołądkowo-jelitowego , takie jak nieswoiste zapalenie jelit i rak okrężnicy , są również możliwymi celami dla dostępnych doustnie przeciwciał jednodomenowych.

Gatunki odporne na działanie detergentów ukierunkowane na białko powierzchniowe Malassezia furfur zostały opracowane do stosowania w szamponach przeciwłupieżowych .

W ramach podejścia do terapii fototermicznej nanociała wiążące się z antygenem HER2 , który jest nadeksprymowany w komórkach raka piersi i jajnika, skoniugowano z rozgałęzionymi nanocząstkami złota (patrz rysunek). Komórki nowotworowe zostały zniszczone fototermicznie przy użyciu lasera w środowisku testowym.

Kaplacyzumab , jednodomenowe przeciwciało skierowane przeciwko czynnikowi von Willebranda, znajduje się w badaniach klinicznych w celu zapobiegania zakrzepicy u pacjentów z ostrym zespołem wieńcowym. Badanie fazy II badające ALX-0081 w przezskórnej interwencji wieńcowej wysokiego ryzyka rozpoczęło się we wrześniu 2009 roku.

Ablynx spodziewa się, że ich nanociała mogą przekraczać barierę krew-mózg i przenikać do dużych guzów litych łatwiej niż całe przeciwciała, co pozwoliłoby na opracowanie leków przeciwko rakowi mózgu .

nanociała, które ściśle wiążą się z domeną RBD białka wypustki betakoronawirusów (w tym SARS-CoV-2 wywołującego COVID-19 ) i blokują interakcje wypustki z receptorem komórkowym ACE2

Doniesiono o zastosowaniu różnych przeciwciał jednodomenowych (nanociał) do zapobiegania i leczenia infekcji różnymi wysoce zjadliwymi ludzkimi koronawirusami (HPhCoV). Perspektywy, siła i wyzwania związane z wdrażaniem nanociał do wiązania i neutralizacji SARS-CoV-2 i podobnych zostały ostatnio podkreślone.

Jedna z najczęstszych przyczyn nagany – Trypanosoma brucei brucei – może być celem sdAbs. Stijlemans i wsp. 2004 odnieśli sukces w indukowaniu skutecznych sdAb u królika i Camelus dromedarius poprzez prezentację antygenu glikoproteiny o zmiennej powierzchni układom odpornościowym kręgowców przy użyciu faga. W przyszłości terapie te przewyższą naturalne przeciwciała, docierając do miejsc obecnie niedostępnych ze względu na większy rozmiar naturalnych przeciwciał.

Linki zewnętrzne

• Molecule of the Month: Nanocodies z Protein Data Bank