DARPin

DARPiny ( akronim dla zaprojektowanych białek powtórzeń ankiryny ) to genetycznie zmodyfikowane białka naśladujące przeciwciała , zazwyczaj wykazujące wysoce specyficzne wiązanie z docelowym białkiem o wysokim powinowactwie. Pochodzą one z naturalnych powtórzeń ankiryny , jednej z najpowszechniejszych klas białek wiążących w przyrodzie, które są odpowiedzialne za różnorodne funkcje, takie jak sygnalizacja komórkowa, regulacja i strukturalna integralność komórki. DARPiny składają się z co najmniej trzech powtarzających się motywów lub modułów, z których najbardziej N- i najbardziej C-końcowe moduły są określane jako „czapki”, ponieważ osłaniają hydrofobowy rdzeń białka. Liczba modułów wewnętrznych jest wskazywana jako liczba (np. N1C, N2C, N3C, ...), podczas gdy zaślepki są oznaczone odpowiednio literami „N” lub „C”. Masa cząsteczkowa np. 14 lub 18 kDa ( kilodaltonów ) dla cztero- (N2C) lub pięcio- (N3C) powtórzeń DARPin jest raczej mała jak na biologię (około 10% wielkości IgG ) .

DARPiny stanowią nową klasę silnych, specyficznych i wszechstronnych małobiałkowych środków terapeutycznych i są wykorzystywane jako narzędzia badawcze w różnych zastosowaniach badawczych, diagnostycznych i terapeutycznych . Molecular Partners AG , firma biofarmaceutyczna na etapie klinicznym z kilkoma cząsteczkami DARPin w badaniach klinicznych i przedklinicznych, obecnie prowadzi własny rozwój terapeutycznych DARPin ( integracja do przodu ). Athebio AG opiera się na dalszym ulepszaniu rusztowania DARPin w celu modelu partnerstwa .

Ponadto DARPiny mogą być stosowane jako białka opiekuńcze krystalizacji dla białek rozpuszczalnych i błonowych, w tym receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR), albo jako partnerzy wiążący, albo jako sztywne fuzje z białkiem docelowym.

Geneza, struktura i generacja

DARPin z pięcioma motywami powtórzeń ankiryny (​)

Platforma DARPin została odkryta i opracowana w laboratorium Andreasa Plückthuna na Uniwersytecie w Zurychu w Szwajcarii podczas studiowania inżynierii i bibliotek rekombinowanych przeciwciał. DARPiny pochodzą z naturalnie występujących białek ankirynowych, klasy białek, która pośredniczy w interakcjach białko-białko o wysokim powinowactwie w naturze.

Biblioteki DARPin zaprojektowano poprzez dopasowanie sekwencji kilku tysięcy naturalnych motywów powtórzeń ankiryny (po około 33 aminokwasach każdy) w połączeniu z projektowaniem opartym na strukturze i metodami rekombinacji DNA . Białka te składają się z powtarzalnych jednostek strukturalnych, które tworzą stabilną domenę białkową o dużej potencjalnej powierzchni oddziaływania z celem. Zazwyczaj DARPiny zawierają cztery lub pięć powtórzeń, z których pierwsze (powtórzenie czapeczki N) i ostatnie (powtórzenie czapeczki C) służą do ochrony hydrofobowego rdzenia białkowego przed środowiskiem wodnym. DARPiny odpowiadają średniej wielkości naturalnych domen białek powtórzeń ankiryny. Białka z mniej niż trzema powtórzeniami (tj. powtórzenia czapeczki i jedno powtórzenie wewnętrzne) nie tworzą wystarczająco stabilnej struktury trzeciorzędowej. Masa cząsteczkowa DARPin zależy od całkowitej liczby powtórzeń, jak pokazano na poniższym wykresie:

Powtórzenia	3	4	5	6	7	...
Przybliżona masa (kDa)	10	14	18	22	26	...

Biblioteki DARPin z randomizowanymi resztami potencjalnej interakcji z celem, z różnorodnością ponad 10 ¹² wariantów, zostały wygenerowane na poziomie DNA. Z tych bibliotek biochemicy mogą wybrać DARPiny do wiązania wybranego celu z powinowactwem pikomolowym , a specyficzność można wybrać za pomocą prezentacji na rybosomach lub prezentacji na fagach przy użyciu sekwencji sygnałowych umożliwiających wydzielanie kotranslacyjne. DARPiny można zaprojektować tak, aby działały jako agoniści receptorów , antagoniści , odwrotni agoniści , inhibitory enzymów lub proste wiązania białek docelowych.

Właściwości i potencjalne zalety DARPin

DARPiny ulegają ekspresji w cytoplazmie Escherichia coli na wysokim poziomie (powyżej 10 g/L w fermentacji, 1 g/L w kolbie do wytrząsania) w postaci rozpuszczalnej . Białka wykazują wysoką stabilność termiczną i termodynamiczną ( punkt środkowy denaturacji : zazwyczaj rozwinięcie równowagi : ∆G > 9,5 kcal/mol ) zwiększającą się wraz ze wzrostem liczby powtórzeń. DARPiny są stabilne w ludzkiej surowicy krwi i można je modyfikować tak, aby nie zawierały epitopów komórek T.

Ze względu na wysoką specyficzność, stabilność, moc i powinowactwo, a także ich elastyczną architekturę, DARPiny mają sztywny tryb wiązania ciała . Multispecyficzne lub multiwalentne konstrukty wykonane przez fuzję genetyczną sugerują, że fuzyjne DARPiny mają podobne właściwości wiążące jak jednodomenowe DARPiny. Brak cystein w rusztowaniu umożliwia inżynierię cystein specyficznych dla miejsca, umożliwiając ukierunkowane na miejsce sprzęganie substancji chemicznych z cząsteczką. W tym samym celu można wprowadzić aminokwasy nienaturalne.

Potencjalnie DARPiny mogą zapewnić korzyści kliniczne poprzez przezwyciężenie ograniczeń konwencjonalnych podejść terapeutycznych, które zazwyczaj są ukierunkowane na pojedynczy szlak chorobowy, a tym samym mogą zagrozić skuteczności. W wielu przypadkach złożoność choroby wynika z rozregulowania wielu szlaków. Technologię DARPin można wykorzystać do szybkiego generowania tysięcy różnych „multi-DARPin”, w których domeny wiążące są połączone (tj. za pomocą łączników), umożliwiając w ten sposób celowanie w kilka szlaków chorobowych. DARPiny i multi-DARPiny można również łączyć z elementami innymi niż DARPiny, takimi jak toksyna, w celu wytworzenia ukierunkowanych środków terapeutycznych, a ich wytwarzanie jest ułatwione dzięki odporności DARPin na agregację. Różnorodność formatów i solidność wielu DARPin ułatwia podejście empiryczne (takie jak badanie przesiewowe oparte na wynikach) w celu skutecznej identyfikacji DARPin o potencjalnej aktywności w określonych szlakach chorobowych.

Potencjalne korzyści DARPin wynikają w dużej mierze z ich właściwości strukturalnych i biofizycznych. Uważa się, że ich mały rozmiar (14-18 kDa) umożliwia zwiększoną penetrację tkanek, a ich wysoka siła działania (<5-100 pM) sprawia, że ​​DARPiny są aktywne w niskich stężeniach. DARPiny są rozpuszczalne w stężeniu >100 g/l, a ich wysoka stabilność i rozpuszczalność są uważane za pożądane właściwości związków leczniczych. DARPiny można wytwarzać szybko i tanio (tj. z E. coli ). Ich właściwości farmakokinetyczne (PK) można dostosować przez fuzję z cząsteczkami wydłużającymi okres półtrwania, takimi jak glikol polietylenowy (PEG) lub z DARPinami wiążącymi się z albuminą surowicy ludzkiej. Ze względu na ich korzystne właściwości biofizyczne uważa się, że DARPiny są wysoce rozwijalne przy użyciu standardowych procesów, potencjalnie wykazując solidne zachowanie klasowe.

Rozwój kliniczny i zastosowania

DARPiny były wykorzystywane jako narzędzia badawcze, jako środki diagnostyczne i jako środki terapeutyczne. MP0112, pierwszy kandydat na DARPin w klinice, jest czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) i wszedł do badań klinicznych w leczeniu wysiękowego zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem (wysiękowe AMD, znane również jako zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem neowaskularnym) i cukrzycowej obrzęk plamki żółtej na początku 2010 r.

Obecnie MP0112 jest badany w trzech różnych badaniach klinicznych. Pierwsze dwa badania to badania bezpieczeństwa i skuteczności abiciparu u pacjentów z wysiękową postacią AMD w celu porównania pacjentów z Japonii i innych krajów. Trzecie badanie ma na celu sprawdzenie bezpieczeństwa i skuteczności abiciparu u pacjentów z DME.

W lipcu 2014 r. firma Molecular Partners rozpoczęła pierwsze badanie na ludziach w celu zbadania bezpieczeństwa, tolerancji i poziomów we krwi MP0250, drugiego kandydata na DARPin, u pacjentów z rakiem.

Molecular Partners AG prowadzi badania przedkliniczne nad kilkoma dodatkowymi DARPinami z potencjalnymi wskazaniami w różnych obszarach chorobowych, w tym w okulistyce , onkologii , immunoonkologii i immunologii .