Dehydrogenaza D-aminokwasów
Dehydrogenaza D-aminokwasów (EC 1.4.99.1 ) jest enzymem bakteryjnym , który katalizuje utlenianie D-aminokwasów do odpowiadających im oksokwasów . Zawiera zarówno żelazo flawinowe , jak i niehemowe jako kofaktory. Enzym ma bardzo szeroką specyficzność i może działać na większość D-aminokwasów.
D-aminokwas + H 2 O + akceptor <=> 2-oksokwas + NH 3 + zredukowany akceptor
Ta reakcja różni się od reakcji utleniania katalizowanej przez oksydazę D - aminokwasową , która wykorzystuje tlen jako drugi substrat, ponieważ dehydrogenaza może wykorzystywać wiele różnych związków jako akceptorów elektronów, przy czym fizjologicznym substratem jest koenzym Q.
Dehydrogenaza D-aminokwasów jest enzymem, który katalizuje NADPH z NADP+ i D-glukozy do produkcji D-aminokwasów i dehydrogenazy glukozowej. Niektóre, ale nie wyłącznie, te aminokwasy to D-leucyna, D-izoleucyna i D-walina, które są niezbędnymi aminokwasami, których ludzie nie mogą syntetyzować ze względu na fakt, że nie są one zawarte w ich diecie. Ponadto D-aminokwasy katalizują tworzenie 2-oksokwasów w celu wytworzenia D-aminokwasów w obecności DCIP, który jest akceptorem elektronów. D-aminokwasy są stosowane jako składniki produktów farmaceutycznych, takich jak antybiotyki, antykoagulanty i pestycydy, ponieważ wykazano, że są nie tylko silniejsze niż ich enancjomery L, ale także bardziej odporne na degradację enzymatyczną. Enzymy dehydrogenazy D-aminokwasów zostały zsyntetyzowane poprzez mutagenezę ze zdolnością do wytwarzania prostych, rozgałęzionych, cyklicznych alifatycznych i aromatycznych D-aminokwasów. aminokwasu ma tendencję do zwiększania powinowactwa do D-alaniny, D-asparaginy i -n-maślanu.
U E. coli dehydrogenaza D-aminokwasu K12 jest najbardziej aktywna, gdy jej substratem jest D-alanina, ponieważ ten aminokwas jest jedynym źródłem węgla, azotu i energii. Enzym działa optymalnie przy pH 8,9 i ma stałą Michaelisa dla D-alaniny równą 30 mM. DAD odkryty w błonie Gram-ujemnej E. coli B może również przekształcać L-aminokwasy w D-aminokwasy.
Dodatkowo dehydrogenaza D-aminokwasowa jest stosowana w dehydrogenazie połączonej z barwnikiem (Dye-DH), która wykorzystuje sztuczne barwniki, takie jak 2,6-dichloroindofenol (DCIP), jako akceptor elektronów zamiast ich naturalnych akceptorów elektronów. Może to przyspieszyć reakcję między enzymem a substratem podczas przenoszenia elektronów.
Zastosowanie w reakcjach syntezy
Dehydrogenaza D-aminokwasowa okazała się skuteczna w syntezie aminokwasów rozgałęzionych, takich jak D-leucyna, D-izoleucyna i D-walina. W omawianym badaniu naukowcom udało się z powodzeniem wykorzystać dehydrogenazę D-aminokwasów do wytworzenia dużych ilości tych produktów z materiału wyjściowego 2-oksokwasów w obecności amoniaku. Warunki do tego były zmienne, chociaż najlepsze wyniki pojawiały się w temperaturze około 65°C.
Aminokwasy otrzymane w tych reakcjach dały wysoką enancjoselektywność >99% i wysoką wydajność >99%.
Ze względu na specyfikę tego enzymu możliwe jest wykorzystanie go do tworzenia nierozgałęzionych D-aminokwasów, jak również zmodyfikowanych D-aminokwasów.
Otrzymywanie dehydrogenazy D-aminokwasowej
W jednym z badań, aby przetestować przydatność wykorzystania dehydrogenazy D-amino w reakcjach syntezy, naukowcy wykorzystali zmutowane bakterie do uzyskania i stworzenia różnych szczepów enzymu. Badacze ci odkryli, że wystarczyło tylko pięć mutacji, aby zmodyfikować selektywną dehydrogenazę D-amino do pracy z innymi D-aminokwasami. Odkryli również, że zachował on swój wysoce selektywny charakter, zdolny do otrzymywania po mutacji głównie enancjomerów D, z wydajnością przekraczającą 95%.
Termostabilny wariant dehydrogenazy D-aminokwasowej znaleziono w bakterii Rhodothermus marinus JCM9785. Wariant ten bierze udział w katabolizmie trans-4-hydroksy-L-proliny.
Z podanych badań wynika, że w celu uzyskania dehydrogenazy D-aminokwasowej należy ją najpierw wprowadzić i wyrazić w obrębie danego gatunku bakterii, z których część została wcześniej wymieniona. Następnie należy go oczyścić w sprzyjających warunkach. Opierają się one na konkretnym gatunku dehydrogenazy D-aminokwasu użytej w danym eksperymencie badawczym. W niewłaściwych warunkach białko może ulec denaturacji. Stwierdzono na przykład, że specyficznie dehydrogenazy D-alaniny z E. coli i P. aeruginosa tracą większość swojej aktywności w temperaturze 37-42°C. Następnie możliwe jest oddzielenie i oczyszczenie istniejącymi metodami.
Sztuczna dehydrogenaza D-aminokwasowa
Ze względu na wady obecnych metod, naukowcy rozpoczęli prace nad stworzeniem sztucznego enzymu zdolnego do wytwarzania tych samych D-aminokwasów, co enzymy ze źródeł występujących naturalnie. Udało im się dodać pięć aminokwasów do danej próbki wyizolowanej z U. thermosphaericus. Modyfikując sekwencję aminokwasów, naukowcy byli w stanie zmienić specyficzność cząsteczki w stosunku do pewnych reagentów i produktów, pokazując, że możliwe jest wykorzystanie sztucznej dehydrogenazy D-aminokwasów do badań przesiewowych w poszukiwaniu niektórych produktów D-aminokwasów.
