Historia i nazewnictwo antygenów ludzkich leukocytów
Antygeny ludzkich leukocytów (HLA) zaczęły się jako lista antygenów zidentyfikowanych w wyniku odrzucenia przeszczepu. Antygeny zostały początkowo zidentyfikowane poprzez kategoryzację i przeprowadzenie obszernych analiz statystycznych dotyczących interakcji między grupami krwi. Proces ten opiera się na zasadzie serotypów . HLA nie są typowymi antygenami, jak te znajdujące się na powierzchni czynników zakaźnych . HLA są antygenami allo , różnią się u poszczególnych osób w wyniku różnic genetycznych. Organ zwany grasicą jest odpowiedzialny za zapewnienie, że każdy Komórkom T , które atakują własne białka, nie pozwala się żyć. Zasadniczo układ odpornościowy każdej osoby jest dostrojony do specyficznego zestawu HLA i własnych białek wytwarzanych przez tę osobę; gdzie to idzie nie tak, gdy tkanki są przenoszone na inną osobę. Ponieważ osoby prawie zawsze mają różne „banki” HLA, układ odpornościowy biorcy rozpoznaje przeszczepioną tkankę jako obcą i niszczy obcą tkankę, co prowadzi do odrzucenia przeszczepu . Dzięki uświadomieniu sobie tego odkryto HLA.
Odkrycie
Myśl, że organizm ssaka musi mieć jakiś sposób na identyfikację wprowadzonych obcych tkanek, pojawiła się po raz pierwszy podczas II wojny światowej . Zaczęło się od katastrofy lotniczej w kulminacyjnym momencie londyńskiego nalotu . Pilot doznał poważnych oparzeń wymagających przeszczepów skóry; jednak przeszczepy skóry były wówczas ryzykownym biznesem, często odrzucanym z nieznanych powodów. Zaproponowano wiele teorii i dopiero w 1958 roku odkryto pierwsze z tych „identyfikujących” białek. Pierwszy znormalizowany system nazewnictwa został ustanowiony w 1968 roku przez WHO Komitet ds. Nomenklatury Czynników Systemu HLA. Badania nad HLA nie rozgrzały się aż do lat 80. XX wieku, kiedy grupa naukowców ostatecznie wyjaśniła kształt białka HLA-A*02 (tylko jednego z wielu specyficznych białek HLA). Jeszcze niedawno, w 2010 r., komitet WHO odpowiedzialny za nazewnictwo wszystkich białek HLA zrewidował swoje standardy nazewnictwa, aby wprowadzić większą przejrzystość i specyficzność w systemie nazewnictwa.
Identyfikacja nie-ja
Peter Medawar był zoologiem, który został klinicystą, specjalizującym się w urazach oparzeniowych. Katastrofa lotnicza w pobliżu jego domu zmieniła ścieżkę jego kariery, zmieniając jego pracę z oparzeniami ze zwykłego środowiska akademickiego w pełną misję ratowania życia. Medawar i szkocki chirurg Tom Gibson otrzymali zadanie pracy na Oddziale Oparzeń Królewskiego Szpitala w Glasgow. Pierwszy wgląd pojawił się, gdy para postanowiła poeksperymentować i wszczepiła część rany skórą pacjenta, a drugą część skórą brata pacjenta. W ciągu kilku dni przeszczepy skóry brata zostały całkowicie zniszczone. Kolejne przeszczepy skóry od brata były niszczone jeszcze szybciej, co dało im dowody potrzebne do powiązania układu odpornościowego. Medawar powtórzył później ten eksperyment na królikach, a 625 operacji potwierdziło później ich wstępne wnioski. Następnie Medawar wyruszył na poszukiwanie powodu, dla którego króliki odrzucały przeszczepy obce.
Medawar kontynuował swoją pracę, tym razem z trzyosobowym zespołem na University College London w latach pięćdziesiątych. Współpracownikami Medawar byli Leslie Brent , doktorant, i Rupert Billingham , pierwszy doktorant Medawar w Oksfordzie kilka lat wcześniej. Dzięki starannie zaplanowanym eksperymentom trio wykazało, że myszy wystawione na działanie komórek niespokrewnionych myszy jako płodów nie odrzucały przeszczepów skóry od tych samych myszy. Za to odkrycie Medawar i australijski naukowiec Macfarlane Burnet otrzymali w 1960 roku Nagrodę Nobla.
Nauczył się tolerancji dla siebie
Burnet, niezależnie od Medawar, doszedł do wniosku, że układ odpornościowy musi nauczyć się tolerować wszelkie własne komórki i postawił hipotezę, że musi to nastąpić podczas rozwoju płodu. Za to wspólnie otrzymał Nagrodę Nobla w 1960 roku. Burnet kontynuował prace iw 1957 wraz z Nielsem Jerne opublikował artykuł, który zmodyfikował i zrewolucjonizował teorię przeciwciał. „Burnet spekulował, że jedna komórka tworzy jeden określony kształt przeciwciała i że wszystkie nasze komórki odpornościowe wytwarzające przeciwciała razem tworzą niewyobrażalnie szeroki repertuar 10 miliardów przeciwciał, z których każdy ma nieco inny kształt”. Tak więc, ilekroć w ludzkim ciele pojawi się obca cząsteczka, jedno z tych przeciwciał będzie miało wystarczająco dokładny kształt, aby związać się z tą cząsteczką. Pomysł ten jest znany jako teoria selekcji klonalnej . W tamtym czasie wielu czołowych naukowców, w tym Linus Pauling i James Watson całkowicie odrzucił ten pomysł, ale wielokrotne eksperymenty mające na celu obalenie teorii faktycznie posłużyły do zbudowania dużego zbioru dowodów potwierdzających teorię Burneta i Jerne'a.
Największą słabością teorii Burneta było to, że nie potrafił wyjaśnić, w jaki sposób organizm selekcjonował komórki odpornościowe, które identyfikowały tylko nie-ja. W 1961 roku Jacques Miller opublikował artykuł zawierający wyjaśnienie. Miller był doktorantem w Chester Beatty Research Institute w Londynie. Jego odkrycie koncentrowało się na grasicy. Grasica od dawna była uważana za nic więcej niż magazyn martwych komórek. Miller nie kupił tej hipotezy. Usuwając grasicę myszy z białaczką we wczesnym okresie życia, odkrył, że myszy miały drastycznie osłabiony układ odpornościowy. Czerpiąc inspirację z prac Medawar nad przeszczepami skóry, przeprowadził serię eksperymentów z przeszczepami skóry, które wykazały, że te myszy z obniżoną odpornością nie odrzucają przeszczepów skóry od myszy nieidentycznych genetycznie. Miller postawił następnie hipotezę, że grasica jest niezbędna w budowie i utrzymaniu układu odpornościowego. W tym momencie Burnet wrócił do obrazu, rozszerzając hipotezę, aby określić, że martwe komórki znalezione w grasicy nie są starymi komórkami odpornościowymi, ale komórkami aktywowanymi przez własne cząsteczki. Innymi słowy, każda komórka, która wiąże się, a tym samym „rozpoznaje” własną cząsteczkę, jest zabijana przed opuszczeniem grasicy. Komórki te okazały się później jednym z trzech typów Limfocyty , komórki T (nazwane tak od ich pochodzenia, grasicy).
Identyfikacja pierwszych HLA
W 1958 roku Jean Dausset, Jon van Rood i Rose Payne opublikowali artykuły, w których opisali przeciwciała w ludzkich surowicach , które reagowały z leukocytami wielu, ale nie wszystkich innych badanych osób. W szczególności Jean Dausset zbadał surowice od pacjentów, którzy otrzymali wielokrotne transfuzje krwi i znalazł siedem surowic, które miały bardzo podobne zachowanie, ponieważ aglutynowały leukocyty od 11 z 19 badanych osób. W ten sposób wykrył alloantygen na ludzkich leukocytach, który następnie nazwał MAC na cześć trzech ważnych ochotników biorących udział w jego eksperymentach. Antygen MAC (później znany jako HLA-A2 ) był obecny u około 60% populacji francuskiej . Za swoje odkrycie Dausset otrzymał Nagrodę Nobla w 1980 roku.
W dalszych badaniach Jon van Rood i Rose Payne kontynuowali badanie surowic od wielu kobiet, które rodziły wiele razy i zidentyfikowali więcej antygenów leukocytów. Mianowicie, w 1962 roku van Rood przeanalizował wzorce reakcji 60 surowic przeciwko leukocytom od 100 dawców i wykrył pozornie dialeliczny układ dwóch antygenów leukocytów, które nazwał 4a i 4b (znane później jako HLA-Bw4 i HLA-Bw6), podczas gdy Payne ze współpracownikami w 1964 wykrył dwa antygeny leukocytarne LA1 i LA2 (później HLA-A1 i HLA-A2 ), pozornie kontrolowane przez allele i zasugerował istnienie co najmniej jednego dodatkowego antygenu, który byłby kontrolowany przez dodatkowy allel w tym samym locus genu . Mniej więcej w tym czasie wielu innych badaczy zaczęło identyfikować więcej antygenów leukocytów.
W tym momencie wszyscy badacze zdali sobie sprawę, że sama ilość danych, które byli w stanie uzyskać, była znacznie większa niż w jakimkolwiek poprzednim badaniu, dlatego współpraca będzie niezbędna. Pierwsze międzynarodowe spotkanie, które odbyło się w 1964 roku, uwypukliło trudności związane z tak masową współpracą. Różne metody eksperymentalne i niespójność w wykonywaniu tych samych testów oraz niejednorodność systemów nazewnictwa razem wzięte sprawiają, że współpraca jest niezwykle trudna.
Wkracza Światowa Organizacja Zdrowia
W 1967 roku Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) zdecydowała, że badania HLA potrzebują oficjalnego systemu nazewnictwa. To z kolei pomogłoby w organizacji i ułatwiłoby ujednolicenie danych gromadzonych w wielu laboratoriach na całym świecie. Komitet ten istnieje do dziś i znacznie przyspieszył tempo badań nad HLA. Pierwsze spotkanie tego komitetu w 1968 r. określiło wytyczne i zasady rządzące HLA. Po pierwsze, geny zgodności zostały podzielone na dwa typy, klasę I i klasę II. Cząsteczki klasy I zidentyfikowano poprzez reakcje między surowicą krwi a komórkami. Cząsteczki klasy II zidentyfikowano na podstawie mieszanin białych krwinek. Po drugie, zmieniono nazwę genów kompatybilności na antygeny ludzkich leukocytów (HLA). Pomimo tego wyjaśnienia i stale rosnącej liczby zidentyfikowanych HLA nikt nie wiedział, jak one działają.
ograniczenie MHC
Pod koniec 1973 roku para naukowców z Australii, Rolf Zinkernagel i Peter Doherty, dokonała rewelacyjnego odkrycia, które na zawsze zmieniło sposób myślenia immunologów. Para prowadziła badania nad infekcjami wirusowymi u myszy i zauważyła, że komórki T, które zapobiegały infekcjom wirusowym u niektórych myszy, nie zawsze zapobiegają tej samej infekcji u innych myszy. Po przyjrzeniu się MHC obecnym u myszy zdali sobie sprawę, że cytotoksyczne limfocyty T mogą identyfikować infekcje wirusowe tylko w komórkach z odpowiednim genem zgodności klasy I. Tradycyjne myślenie było takie, że układ odpornościowy bezpośrednio identyfikuje infekcje, ale to odkrycie odwróciło tę teorię do góry nogami. Geny zgodności były niezbędne w usuwaniu wirusów za pośrednictwem układu odpornościowego. Para ukuła termin „ograniczenie MHC”, aby opisać związek między komórkami T, specyficznymi białkami MHC i wykrywaniem wirusów. W 1975 roku w artykule w czasopiśmie Lancet wprowadzili pojęcie „odmienionego ja”, co oznacza, że wirusy zmieniają białka MHC i ta zmiana jest wykrywana przez limfocyty T. Za swoją pracę otrzymali w 1996 roku Nagrodę Nobla. Potrzeba było pracy wielu innych, aby ustalić, w jaki sposób limfocyty T dokonały tej identyfikacji.
Odkrywanie kształtu białka
Prawie wszystkie ważne cząsteczki w organizmie są białkami . Białka działają dzięki temu, że każde z nich ma określoną sekwencję aminokwasów i określony kształt. Ustalenie kolejności aminokwasów jest stosunkowo proste. Znalezienie kształtu wymaga użycia krystalografii rentgenowskiej i wcale nie jest łatwe. Zespół trzech badaczy z Harvardu: Don Wiley , Jack Strominger i Pamela Bjorkman , osiem lat, aby wytropić strukturę białka HLA. Pracowali konkretnie z HLA-A*02. Bjorkman wykonał większość pracy nóg iw ciągu siedmiu lat udało mu się poskładać strukturę 90% białka. Te ostatnie 10% było jednak nieuchwytne. Ostateczne ujawnienie kompletnej struktury HLA-A*02 zajęło kolejny rok pracy. Ukończyli swoją pracę wiosną 1987 roku, odkrywając, że ostatnie 10% tworzyło „swoisty kubek” umieszczony na szczycie cząsteczki. Był to idealny rozmiar do przechowywania peptydów. Inni badacze ustalili wcześniej, że limfocyty T mogą rozpoznawać komórki zakażone wirusem, komórki, którym wstrzyknięto pojedyncze białko wirusa, a nawet komórki, którym wstrzyknięto fragmenty białka wirusa. Odkrycie struktury białka HLA wyraźnie pokazało, że białka HLA utrzymują wirusowe peptydy w rowku wiążącym. Ale zespół badawczy z Harvardu nie skończył. Zaobserwowali również, że w rowku wiążącym cząsteczek HLA, których użyli do określenia kształtu, wyraźnie znajdował się peptyd. Jednak komórki, z których wyekstrahowali białko, zdecydowanie nie były zainfekowane żadnymi wirusami powodującymi choroby. Wniosek, który wyciągnęli i wniosek, który utkwił do dziś, jest taki, że cząsteczki HLA mogą wiązać zarówno własne, jak i obce peptydy.
Nomenklatura
Obecny system nazewnictwa HLA
Najnowszy system nazewnictwa HLA został opracowany w 2010 roku przez Komitet WHO ds. Czynników Systemu HLA. Istnieją dwa rodzaje MHC, klasa I i klasa II. Oba są nazywane przy użyciu tego samego systemu. Obecnie istnieje 7678 alleli klasy I i 2268 alleli klasy II.
| HLA klasy I i ilości białek | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Gen | A | B | C | mi | F | G |
| Allele | 2432 | 3086 | 2035 | 13 | 22 | 50 |
| Białka | 1740 | 2329 | 1445 | 5 | 4 | 16 |
| Allele pseudogenów HLA klasy I | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Gen | H | J | k | Ł | P | V |
| Allele | 12 | 9 | 6 | 5 | 5 | 3 |
| Allele i białka HLA klasy II | ||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Gen | DRA | DRB | DQA1 | DQB1 | DPA1 | DPB1 | DMA | DMB | DOA | Data urodzenia |
| Allele | 7 | 1476 | 51 | 459 | 37 | 193 | 7 | 13 | 12 | 13 |
| Białka | 2 | 1091 | 32 | 303 | 19 | 160 | 4 | 7 | 3 | 5 |
| Gen | DRB1 | DRB2 | DRB3 | DRB4 | DRB5 | DRB6 | DRB7 | DRB8 | DRB9 | |
| Allele | 1375 | 1 | 58 | 15 | 20 | 3 | 2 | 1 | 1 | |
| Białka | 1020 | 0 | 46 | 8 | 17 | 0 | 0 | 0 | 0 |
Nazewnictwo HLA może początkowo być dość mylące. Wszystkie allele zaczynają się od „HLA”, co oznacza, że są częścią ludzkich genów MHC. Następna część (HLA -A lub HLA -B ) identyfikuje gen, którego allel jest modyfikacją. Pierwsze dwie cyfry (HLA-A *02 ) oznaczają typ antygenu danego allelu, co zazwyczaj oznacza obecność antygenu serologicznego. Innymi słowy, HLA z tym samym typem antygenu (HLA-A*02:101 i HLA-A*02:102) nie będą reagowały ze sobą w testach serologicznych. Kolejny zestaw cyfr (HLA-A*02 :101 ) wskazuje, jakie białko koduje allel, i są one kolejno ponumerowane w kolejności, w jakiej zostały odkryte. Każdy HLA, który ma tutaj inny numer, wytwarza inne białko (AKA ma zmianę nukleotydu, która zastępuje aminokwas innym). Trzeci zestaw liczb (HLA-A*02:101 :01 ) wskazuje wariant allelu, który ma inną sekwencję DNA, ale wytwarza to samo białko, co normalny gen. Końcowy zestaw liczb (HLA-A*02:101:01 :01 ) stosuje się do określenia polimorfizmu pojedynczego lub wielu nukleotydów w niekodującym regionie genu. Ostatnim aspektem nazewnictwa HLA jest litera (HLA-A*02:101:01:01 L ). Jest sześć liter, każda o innym znaczeniu.
| List | Znaczenie |
|---|---|
| N | Allel zerowy (wytwarza niefunkcjonalne białko) |
| Ł | Niższa niż normalna ekspresja na powierzchni komórki |
| S | Rozpuszczalne białko nie występuje na powierzchni komórki |
| Q | Wątpliwy (allel może wpływać na normalną ekspresję) |
| C | Białko obecne w cytoplazmie, ale nie na powierzchni komórki |
| A | Nieprawidłowa ekspresja (niepewne, czy białko jest wyrażane) |
Ustanowienie systemu
Osoba może mieć 2 białka antygenowe na locus genetyczny (jeden gen od każdego rodzica). Po pierwszym odkryciu zidentyfikowane antygeny były skupione, tworząc grupy, w których u danej osoby znaleziono nie więcej niż dwa antygeny na klaster. Grupa serotypów „A” obejmowała HL-A1, A2, A3, A9, A10, A11. Kolejna gromada, „B”, zawierała A7, A8, A12, A13, A14, A15. Stwierdzono obecność antygenu HL-A4 na komórkach limfatycznych. Ponieważ „HL-Antigens” nie należały już do jednej grupy, potrzebny był nowy system nazewnictwa.
W 1968 roku po raz pierwszy zebrał się Komitet ds. Nomenklatury WHO ds. Nomenklatury Systemu HLA. Stworzyli system, który podzielił HLA na HLA-A i HLA-B, A i B odpowiadające grupie serotypów reaktywnych. Na przykład „HL-A2” stało się HLA-A2 , „HL-A7” stało się HLA-B7 , a „HL-A8” stało się HLA-B8 .
W tym układzie były komórki, które były „puste” lub miały nowe specyficzności , te nowe antygeny nazwano antygenami „W”, a gdy zostały ponownie przypisane do nowych grup, na przykład serotypów „A”, stały się antygenami Aw lub Bw. Stwierdzono, że niektóre antygeny, które zachowywały się jak antygeny A i B, można było wykluczyć na podstawie wykluczenia „2-type max”. W ten sposób powstała nowa grupa „C”. Klasyfikacja C jest nadal w toku i zachowały one nazwę Cw, ponieważ wiele serotypów nie zostało opracowanych.
Klasyfikacja antygenów „A4” była skomplikowana. Podzbiór „A4” ewoluował, by stać się antygenami regionu D, które były dużym skupiskiem genów kodujących MHC klasy II. Nastąpiło kilka zmian nazw. Region D ma 8 głównych loci kodujących, które łączą się, tworząc 3 różne grupy białek; DP, DQ i DR. Antygeny DRw były pierwszymi, które uległy rozszczepieniu, co było łatwe dzięki niezmiennemu łańcuchowi alfa, ale skomplikowane przez 4 loci łańcucha beta (DRB1, DRB3, DRB4 i DRB5). Serotypy do DQ reagowały z łańcuchami alfa i beta lub obydwoma pewnymi izoformami. Właściwa klasyfikacja była w dużym stopniu wspomagana przez sekwencjonowanie genów i PCR. Trwa klasyfikacja i opis antygenów DP.
Genetyka
Złożoność genetyczna jest typowa dla HLA
Nazywanie ludzkich antygenów leukocytów „ antygenami ” HLA jest głęboko zakorzenione w historii odkrywania ich serotypów i alleli . Nie ma wątpliwości, że terminologia HLA może być zdumiewająca, ta terminologia jest konsekwencją złożonej genetyki, a także sposobu scharakteryzowania tych antygenów.
Perspektywa historyczna jest ważna dla zrozumienia sposobu usystematyzowania HLA. W transplantologii celem było wyjaśnienie biorcom odrzucenia przeszczepu i oczywiście zapobieżenie odrzuceniu w przyszłości. Z tej perspektywy przyczyną odrzuceń okazały się „antygeny”. W ten sam sposób, w jaki antygeny bakteryjne mogą wywoływać reakcję zapalną, antygeny HLA pochodzące od dawcy narządu powodowały odpowiedź zapalną po umieszczeniu w biorcy. Nazywa się to odrzuceniem alloprzeszczepu [allo = inny, przeszczep (medyczny) = przeszczep].
Aby w skrócie wyjaśnić odrzucenie, niektóre elementy układu odpornościowego są bardzo zmienne, czynniki te nazywane są antygenami głównej zgodności tkankowej (MHC). Antygeny MHC powodują odrzucenie niewłaściwie dobranych przeszczepów narządów. Zmienność wynika z genetyki. Z perspektywy ewolucji człowieka, dlaczego antygeny MHC są tak zmienne, podczas gdy wielu innym ludzkim białkom brakuje zmienności? Przyczyna choroby gospodarza przeciwko przeszczepowi może w rzeczywistości wynikać z funkcji systemu.
Użycie słowa alloantygen w rzeczywistości maskuje fakt, że HLA rzadko są autoantygenami u dawcy, a zatem ich funkcja nie jest antygenem, ale czymś innym. Ale nazewnictwo tych antygenów nie wynika z funkcji, ale z potrzeby dopasowania dawców narządów do biorców.
Transplantacja i odrzucenie przeszczepu
Prosty przykład antygenu HLA powodującego odrzucenie A1, A2, B7, B8 nie powodują reakcji, ponieważ występują zarówno u dawcy, jak i biorcy, DR2 i DR3 znajdują się na komórkach limfatycznych
Na początku lat 60. niektórzy lekarze rozpoczęli bardziej agresywne próby przeszczepiania narządów . Niewiele wiedząc o czynnikach kompatybilności , podjęli próbę transplantacji między ludźmi oraz między nie-ludźmi a ludźmi. Leki immunosupresyjne działały przez jakiś czas, ale przeszczepiane narządy albo zawsze zawodziły, albo pacjenci umierali z powodu infekcji. Pacjenci otrzymywali od innych dawców skórę, krwinki białe lub nerki (tzw. alloprzeszczepy , co oznacza przeszczepy „różnej genetyki”). Jeśli te alloprzeszczepy zostały odrzucone, stwierdzono, że odpowiedzi „odrzucenia” towarzyszyła aglutynacja krwinek czerwonych, w której pośredniczyły przeciwciała (patrz rysunek). Rozpoczęto poszukiwania tych antygenów powierzchniowych komórek. Istnieje kilka procesów, w których przeciwciała mogą zmniejszać funkcję:
- Ostre odrzucenie - przeciwciała mogą przyciągać limfocyty i powodować ich lizę komórek za pośrednictwem klasycznego szlaku dopełniacza układu odpornościowego
- Przeciwciała mogą wiązać się i zmieniać funkcję (np. przepływ płynu lub zapobieganie wiązaniu ligandów z receptorami)
- cytokin , które powodują reakcje ogólnoustrojowe.
Można zidentyfikować różne antygeny
Na załączonym rysunku dwa podobne haplotypy (nieznane wczesnym klinicystom) są identyczne, z wyjątkiem jednego antygenu w górnym haplotypie. Przeszczep może nie zostać odrzucony, ale jeśli nastąpi odrzucenie, allotypowe białko, alloantygen , w tkance dawcy mogło indukować dominujące przeciwciało alloreaktywne u biorcy.
Oznaczanie surowicy odpornościowej
Test hemaglutynacji . Tworząc odpowiedź immunologiczną na antygen, komórki B przechodzą przez proces dojrzewania, od powierzchniowej produkcji IgM, przez produkcję IgM w surowicy, aż do dojrzewania w komórce plazmatycznej produkującej IgG. Biorcy przeszczepu, którzy generują odpowiedź immunologiczną, mają zarówno IgM, jak i IgG. IgM można stosować bezpośrednio w hemaglutynacji testy, przedstawione po prawej stronie. IgM ma 10 regionów wiążących antygen na cząsteczkę, co umożliwia sieciowanie komórek. Surowica odpornościowa specyficzna dla HLA-A3 będzie następnie aglutynować krwinki czerwone zawierające HLA-A3, jeśli stężenie IgM w surowicy odpornościowej jest wystarczająco wysokie. Alternatywnie, drugie przeciwciało skierowane przeciwko regionowi niezmiennemu (Fc ) IgG można zastosować do sieciowania przeciwciał na różnych komórkach, powodując aglutynację.
Test wiązania dopełniacza . Test wiązania dopełniacza zmodyfikowano w celu oznaczenia lizy krwinek czerwonych, w której pośredniczy surowica odpornościowa.
Test uwalniania chromu . Ten test mierzy uwalnianie (biologicznego) radioaktywnego chromu z komórek w wyniku aktywności komórek zabójców. Komórki te są przyciągane do antygenów klasy I, które albo niosą obce antygeny, albo są obce układowi odpornościowemu.
Rola haplotypów w identyfikacji antygenów
| Haplotyp 1 | Haplotyp 2 | |||||
| Przykład 1 | A | Cw | B | A | Cw | B |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Dawca | 1 | 7 | 8 | 3 | 7 | 7 |
| Odbiorca | 1 | 7 | 8 | 2 | 7 | 7 |
| Alloreaktywność | 3 | |||||
| Przykład 2 | ||||||
| Dawca | 1 | 7 | 8 | 2 | 7 | 8 |
| Odbiorca | 1 | 7 | 8 | 3 | 7 | 8 |
| Alloreaktywność | 2 | |||||
Każda osoba ma dwa haplotypy HLA , kasetę genów przekazywanych od każdego z rodziców. Częstotliwości haplotypów u Europejczyków są w silnej nierównowadze sprzężeń . Oznacza to, że częstość niektórych haplotypów jest znacznie wyższa w stosunku do oczekiwań opartych na losowym sortowaniu alleli genów. Pomogło to w odkryciu antygenów HLA, ale było nieznane pionierom.
W tabelach przypadkowy przeszczep między dwoma niespokrewnionymi osobnikami dał surowicę odpornościową na pojedynczy alloantygen. Odkrywając te bliskie, ale nieidentyczne dopasowania, zidentyfikowano proces z nieco pokrewnymi antygenami powierzchniowymi haplotypów dla HLA A, aw poniższej tabeli, HLA B w tamtym czasie, jednak wszystkie zostały zgrupowane razem jako antygeny HL. Po lewej stronie antygeny „B” i „cw” są dopasowane (B i C są blisko siebie, więc jeśli B pasuje, to C prawdopodobnie również pasuje), ale antygeny A nie są dopasowane. Surowicą odpornościową wytwarzaną przez biorcę jest najprawdopodobniej A3, ale jeśli kierunek przeszczepu jest odwrócony, prawdopodobnym alloantygenem jest A2. Dwa z pierwszych trzech alloantygenów są zatem łatwe do wykrycia ze względu na podobieństwo i częstość występowania haplotypów A2-B7 i A3-B7 (patrz przykład 1).
| Haplotyp 1 | Haplotyp 2 | |||||
| Przykład 3 | A | Cw | B | A | Cw | B |
| Dawca | 1 | 7 | 8 | 1 | 7 | 7 |
| Odbiorca | 1 | 7 | 8 | 1 | 7 | 8 |
| Alloreaktywność | 7 | |||||
| Przykład 4 | ||||||
| Dawca | 3 | 7 | 7 | 1 | 7 | 8 |
| Odbiorca | 3 | 7 | 7 | 1 | 7 | 7 |
| Alloreaktywność | 8 | |||||
W takich przypadkach A1/A2, A2/A3, A1/A3 są dopasowane, co zmniejsza prawdopodobieństwo odrzucenia, ponieważ wiele z nich jest powiązanych z danym haplotypem. Czasami „rekombinowany” A1-Cw7-B7 (rzadko), B7 staje się alloantygenem u biorcy z A1-Cw7-B8 (powszechny).
Ta nierównowaga powiązań u Europejczyków wyjaśnia, dlaczego najpierw zidentyfikowano A1, A2, A3, „A7” [B7] i „A8” [B8]. Identyfikacja innych alleli zajęłaby znacznie więcej czasu, ponieważ częstotliwości były niższe, a haplotypy, które migrowały do populacji europejskiej, przeszły równowagę lub pochodziły z wielu źródeł.
To jest tło genetyczne, na podstawie którego naukowcy próbowali odkryć i zrozumieć antygeny zgodności tkankowej.
Lista utworzonych antygenów
Pod koniec lat 60. XX wieku naukowiec zaczął reagować na surowice pacjentów odrzucających przeszczepy na tkanki dawcy lub „strony trzeciej”. Ich surowica (płynna część krwi podczas krzepnięcia) została uwrażliwiona na komórki od dawców - była alloreaktywna . Testując różne surowice odpornościowe od biorców, udało im się odkryć niektóre z unikalnymi reaktywnościami. W rezultacie naukowcom udało się zidentyfikować kilka antygenów. Początkowo pierwsze antygeny nazwano antygenami Hu-1 i wstępnie oznaczono jako produkty genowe ludzkiego odpowiednika mysiego locus zgodności tkankowej (H2). W 1968 roku odkryto, że dopasowanie tych antygenów między dawcą a biorcą nerki zwiększa prawdopodobieństwo przeżycia nerki u biorcy. Lista antygenów nadal istnieje, chociaż została przeorganizowana, aby pasowała do tego, czego dowiedzieliśmy się o genetyce, udoskonalona i znacznie rozszerzona.
Rozpoznano antygeny zawierające limfocyty
W miarę postępu badań tych surowic „odrzucających” i antygenów „allo” rozpoznano pewne wzorce rozpoznawania przeciwciał. Pierwszą ważną obserwacją z 1969 roku było to, że allotypowe przeciwciała przeciwko „4” („Cztery”) znaleziono tylko na limfocytach, podczas gdy większość antygenów, określanych jako „LA”, rozpoznawała większość komórek w organizmie.
Ten antygen grupy „4” na limfocytach rozszerzyłby się do „4a”, „4b” i tak dalej, stając się serią „D” (antygeny HLA-D (klasa II)) DP, DQ i DR. To jest ciekawa historia sama w sobie.
Antygeny Hu-1 przemianowano na allo-antygeny ludzko-limfoidalne (HL) (HL-As). Alloantygen pochodzi z obserwacji, że tolerowane białko u dawcy staje się antygenowe u biorcy. Można to porównać z autoantygenem , w którym osoba wytwarza przeciwciała przeciwko jednemu lub większej liczbie własnych białek. Sugerowało to również, że dawca i biorca mają inny skład genetyczny tych antygenów. Następnie grupa „LA” składała się z HL-A1, A2, A3, A5, A6, A7, A8, A9, A10, A11, A12, A13, A14 i A15, dopóki dalsze podziały i zmiana nazwy nie były konieczne. Niektóre z powyższych antygenów, na przykład HL-A1, są podobne do HLA-A1 , ponieważ są to te same serotypy. Niektóre z powyższych, jak A5, nie są wymieniane w ciągu ostatnich kilku lat, ponieważ zostały przemianowane.
Podczas tych wczesnych badań okazało się, że istnieje związek z wieloma chorobami autoimmunologicznymi. A haplotyp HLA A1-B8 jest powiązany z bardzo długim fragmentem konserwatywnego wariantu chromosomu 6, zwanego haplotypem AH8.1 . W tych badaniach , że HL-A1,8 jest powiązany z chorobą. To powiązanie niekoniecznie jest funkcją któregokolwiek z genów, ale konsekwencją sposobu, w jaki ewoluował AH8.1.
Podklasyfikacja antygenów limfoidalnych
Seria testów na hodowanych komórkach wykazała, że w grupie „LA” tkanka dawcy może mieć pewne antygeny, ale nie inne. Na przykład surowica odpornościowa może reagować wzorami (na danej tkance):
- A1, A2, A7, A12
- A1, A3, A7, A8
- A1, A11, A8, A5
- A1, A8
Ale nie reaguj w następujący sposób:
- A1, A2, A3, ...
- A1, A2, A11, ....
- A2, A3, A11, ....
- ... A7, A8, A12
Seria serotypów HLA
Seria „A”
|
Jeśli wpisano 2 członków serii (A1, 2, 3, 9, 10, 11), nie zaobserwowano reakcji z trzecim członkiem serii na dawcę. Ta „wyłączność” identyfikowała serię „A”. Można zauważyć podobieństwa tej serii numerycznej z serią HLA-A , ponieważ antygeny serii „A” są pierwszymi sześcioma członkami HLA-A . Nieumyślnie naukowiec odkrył zestaw przeciwciał, który rozpoznawał tylko produkty genów z jednego locus, genu HLA-A „antygeny” są produktami genów. Wynika z tego, że alloreaktywne surowice odpornościowe mogą być narzędziem do identyfikacji genetycznej.
Seria „B”
Niedługo po tym, jak antygeny z serii A zostały oddzielone od (szybko rozszerzającej się) listy antygenów, ustalono, że inna grupa również może zostać oddzielona według tych samych logicznych linii. W tej grupie znalazły się HL-A5, A7, A8, A12. Stało się to serią „B”. Należy zwrócić uwagę na podobieństwo serii „B” do kilku pierwszych członków serotypów HLA-B . Nazwy tych antygenów zostały koniecznie zmienione, aby pasowały do nowej domniemanej serii, do której zostały przypisane. Od HL-A# do HLA-B#. Problem polegał na tym, że literatura używała „A7” i wkrótce miała używać „B7” jako skrótu dla HLA-B7 .
Pseudo-seria „w”
Ponieważ na początku lat siedemdziesiątych było już pewne, że „antygeny” były kodowane przez różne serie, niejawne loci, listy numeryczne stały się nieco kłopotliwe. Wiele grup odkrywało antygeny. W takich przypadkach antygenowi przypisywano tymczasową nazwę, na przykład „RoMa2”, i po dyskusji następną otwartą szczelinę numeryczną można było przypisać, ale nie do serii „A” lub „B”, dopóki nie przeprowadzono odpowiednich testów. Aby obejść ten problem, często przypisywano numer „warsztatowy” „w#”, podczas gdy kontynuowano testy w celu określenia, do której serii należał antygen.
Seria „C”
Wkrótce odkryto serię „C”. Seria C okazała się trudna do serotypowania, a allele w tej serii nadal mają znacznik „w” oznaczający ten status; dodatkowo przypomina, że Seria C nie miała nadanych nazw w taki sam sposób jak Seria A i B, ma własną listę numeryczną Cw1, Cw2, Cw3.
Rozszerzanie i udoskonalanie grup serotypowych
W połowie lat siedemdziesiątych badania genetyczne wreszcie zaczęły nadawać sens prostej liście antygenów, odkryto nową serię „C”, a badania genetyczne z kolei ustaliły kolejność HLA-A, C, B i D kodowanie loci na człowieku 6p . Wraz z nową serią pojawiły się nowe antygeny; Cw1 i 2 zostały szybko wypełnione, chociaż pisanie Cw było opóźnione. Prawie połowa antygenów nie mogła zostać rozwiązana przez serotypowanie na początku lat 90-tych. Obecnie genetyka definiuje 18 grup.
W tym momencie Dw był nadal używany do identyfikacji antygenów DR, DQ i DP. Zdolność do identyfikacji nowych antygenów znacznie przewyższała zdolność do charakteryzowania tych nowych antygenów.
Gdy technologia transplantacji została wdrożona na całym świecie, stało się jasne, że te antygeny były dalekie od kompletnego zestawu, aw rzeczywistości były mało przydatne w niektórych obszarach świata (np. w Afryce lub potomkach Afrykanów). Niektóre przeciwciała do serotypowania okazały się słabe, z szeroką specyficznością, i odkryto nowe serotypy, które dokładniej identyfikowały mniejszy zestaw antygenów. Te szerokie grupy antygenów, takie jak A9 i B5, podzielono na „rozszczepione” grupy antygenów, odpowiednio A23 i A24 oraz B51 i B52. Wraz z rozwojem serotypowania HL-A rozwijała się identyfikacja nowych antygenów.
Identyfikacja genetyczna
We wczesnych latach 80-tych odkryto, że fragment restrykcyjny segreguje się z osobnikami, którzy są nosicielami serotypu HLA-B8 . W 1990 roku odkryto, że pojedyncza różnica w sekwencji aminokwasowej między HLA-B44 (B*4401 a B*4402) może skutkować odrzuceniem alloprzeszczepu. To odkrycie wydawało się sprawiać, że strategie dopasowywania oparte na serotypowaniu były problematyczne, jeśli istniało wiele takich różnic. W przypadku B44 antygen został już odszczepiony z szerokiej grupy antygenów B12. W 1983 r. sekwencje cDNA wszystkich trzech sekwencji HLA-A3 i Cw3 dobrze porównywały się z mysimi antygenami MHC klasy I. Zachodnioeuropejski HLA-B7 antygen został zsekwencjonowany (chociaż pierwsza sekwencja zawierała błędy i została zastąpiona). W krótkim czasie zsekwencjonowano wiele alleli HLA klasy I, w tym 2 allele Cw1.
Do roku 1990 zaczęto rozumieć pełną złożoność antygenów HLA klasy I. W czasie, gdy określano nowe serotypy, problem z wieloma allelami dla każdego serotypu stawał się widoczny dzięki sekwencjonowaniu nukleotydów. RFLP pomogła określić nowe allele, ale sekwencjonowanie było dokładniejsze. W latach 90. opracowano zestawy PCR, zwane zestawami SSP-PCR, które umożliwiły, przynajmniej w optymalnych warunkach, oczyszczanie DNA, identyfikację alleli za pomocą PCR i żelu agarozowego w ciągu 8 godzin dziennie. Allele, których nie można było jednoznacznie zidentyfikować za pomocą serotypu i PCR, można było zsekwencjonować, co pozwoliło na udoskonalenie nowych zestawów PCR.
Serotypy, takie jak B*4401, B*4402, B*4403, z których każdy obfituje w serotypy B44, można było określić z jednoznaczną dokładnością. Genetyka molekularna znacznie rozwinęła technologię HLA w stosunku do technologii serotypowania, ale serotypowanie nadal istnieje. Serotypowanie pozwoliło zidentyfikować najbardziej podobne antygeny, które obecnie tworzą podgrupy HLA. Serotypowanie może ujawnić, czy antygen kodowany przez odpowiedni gen HLA ulega ekspresji. Allel HLA kodujący niewyrażany gen jest określany jako „allel zerowy”, na przykład: HLA-B*15:01:01:02N. Poziom ekspresji można również wykryć przez serotypowanie, gen HLA kodujący antygeny, który ma niską ekspresję białka na powierzchni komórki jest określany jako „osoba o niskiej ekspresji”, na przykład: HLA-A*02:01:01:02L.