Mikrosatelita

Ten artykuł dotyczy sekwencji DNA. W przypadku małych orbitujących statków kosmicznych zobacz Mikrosatelita (loty kosmiczne) .

Mikrosatelita to odcinek powtarzalnego DNA , w którym pewne motywy DNA (o długości od jednej do sześciu lub więcej par zasad ) są powtarzane, zwykle 5–50 razy. Mikrosatelity występują w tysiącach miejsc w genomie organizmu . Mają wyższy mutacji niż inne obszary DNA, co prowadzi do dużej różnorodności genetycznej . Mikrosatelity są często określane genetyków sądowych jako krótkie powtórzenia tandemowe ( STR ) . genealogii genetycznej lub prostych powtórzeń sekwencji ( SSR ) przez genetyków roślin.

Mikrosatelity i ich dłużsi kuzyni, minisatelity , razem są klasyfikowane jako DNA VNTR (zmienna liczba powtórzeń tandemowych ). Nazwa „satelitarny” DNA odnosi się do wczesnych obserwacji, że wirowanie genomowego DNA w probówce oddziela wyraźną warstwę masowego DNA od towarzyszących „satelitarnych” warstw powtarzalnego DNA.

Są szeroko stosowane do profilowania DNA w diagnostyce nowotworów , analizie pokrewieństwa (zwłaszcza testach na ojcostwo ) oraz w identyfikacji kryminalistycznej. Są również wykorzystywane w powiązań genetycznych w celu zlokalizowania genu lub mutacji odpowiedzialnej za daną cechę lub chorobę. Mikrosatelity są również wykorzystywane w genetyce populacji do pomiaru poziomów pokrewieństwa między podgatunkami, grupami i osobnikami.

Historia

Chociaż pierwszy mikrosatelita został scharakteryzowany w 1984 roku na Uniwersytecie w Leicester przez Wellera, Jeffreysa i współpracowników jako polimorficzne powtórzenie GGAT w ludzkim genie mioglobiny, termin „mikrosatelita” został wprowadzony później, w 1989 roku, przez Litta i Luty'ego. Nazwa „satelitarne” DNA odnosi się do wczesnej obserwacji, że wirowanie genomowego DNA w probówce oddziela widoczną warstwę masowego DNA od towarzyszących „satelitarnych” warstw powtarzalnego DNA. Rosnąca dostępność amplifikacji DNA metodą PCR na początku lat 90. XX wieku zapoczątkowała wiele badań wykorzystujących amplifikację mikrosatelitów jako markerów genetycznych w medycynie sądowej, testach ojcostwa i klonowaniu pozycyjnym w celu znalezienia genu leżącego u podstaw cechy lub choroby. Wybitne wczesne zastosowania obejmują identyfikację za pomocą genotypowania mikrosatelitarnego ośmioletnich szczątków brytyjskiej ofiary morderstwa (Hagelberg et al. 1991) oraz lekarza obozu koncentracyjnego Auschwitz Josef Mengele , który uciekł do Ameryki Południowej po II wojnie światowej (Jeffreys et al. 1992).

Struktury, lokalizacje i funkcje

Mikrosatelita to ciąg tandemowo powtórzonych (tj. sąsiadujących) motywów DNA o długości od jednego do sześciu lub do dziesięciu nukleotydów (dokładna definicja i zarys dłuższych minisatelitów różni się w zależności od autora) i są zazwyczaj powtarzane 5– 50 razy. Na przykład sekwencja TATATATATA jest mikrosatelitą dinukleotydową, a GTCGTCGTCGTCGTC jest mikrosatelitą trinukleotydowym (gdzie A oznacza adeninę , G guaninę , C cytozynę i T tyminę ). Powtarzające się jednostki składające się z czterech i pięciu nukleotydów są określane odpowiednio jako motywy tetra- i pentanukleotydowe. Większość eukariontów ma mikrosatelity, z godnym uwagi wyjątkiem niektórych gatunków drożdży. Mikrosatelity są rozmieszczone w całym genomie. Na przykład ludzki genom zawiera 50 000–100 000 mikrosatelitów dinukleotydowych i mniejszą liczbę mikrosatelitów tri-, tetra- i pentanukleotydowych. Wiele z nich znajduje się w niekodujących częściach ludzkiego genomu i dlatego nie wytwarza białek, ale mogą one również znajdować się w regionach regulatorowych i regiony kodujące .

Mikrosatelity w regionach niekodujących mogą nie pełnić żadnej określonej funkcji i dlatego mogą nie zostać wybrane ; pozwala im to na gromadzenie mutacji bez przeszkód przez pokolenia i powoduje zmienność, którą można wykorzystać do pobierania odcisków palców DNA i celów identyfikacji. Inne mikrosatelity zlokalizowane są w regulacyjnych regionach flankujących lub intronowych genów lub bezpośrednio w kodonach genów – mutacje mikrosatelitarne w takich przypadkach mogą prowadzić do zmian fenotypowych i chorób, zwłaszcza w chorobach ekspansji trojaczków , takich jak zespół łamliwego chromosomu X i choroba Huntingtona .

Telomery to liniowe sekwencje DNA, które znajdują się na samych końcach chromosomów i chronią integralność materiału genomowego (podobnie jak aglet na końcu sznurowadła) podczas kolejnych rund podziału komórki z powodu „problemu replikacji końca”. Wykazano, że w białych krwinkach stopniowe skracanie telomerowego DNA odwrotnie koreluje ze starzeniem w kilku typach próbek. Telomery składają się z powtarzalnego DNA, z motywem powtórzeń heksanukleotydów TTAGGG u kręgowców. [ potrzebne źródło ] Są zatem klasyfikowane jako minisatelity . Podobnie owady mają krótsze powtarzające się motywy w swoich telomerach, które można prawdopodobnie uznać za mikrosatelity. [ potrzebne źródło ]

Mechanizmy mutacji i częstość mutacji

Poślizg nici DNA podczas replikacji locus STR. Pudełka symbolizują powtarzające się jednostki DNA. Strzałki wskazują kierunek, w którym nowa nić DNA (białe pola) jest replikowana z nici wzorcowej (czarne pola). Przedstawiono trzy sytuacje podczas replikacji DNA. (a) Replikacja locus STR przebiegła bez mutacji. (b) Replikacja locus STR doprowadziła do wzmocnienia o jedną jednostkę dzięki pętli w nowej nici; nieprawidłowa pętla jest stabilizowana przez jednostki flankujące komplementarne do przeciwległej nici. (c) Replikacja locus STR doprowadziła do utraty jednej jednostki z powodu pętli w nici szablonu. (Forster i in. 2015)

W przeciwieństwie do mutacji punktowych , które wpływają tylko na pojedynczy nukleotyd, mutacje mikrosatelitarne prowadzą do uzyskania lub utraty całej jednostki powtórzeń, a czasami dwóch lub więcej powtórzeń jednocześnie. Zatem oczekuje się, że szybkość mutacji w loci mikrosatelitarnych będzie się różnić od innych szybkości mutacji, takich jak szybkości podstawienia zasad. Rzeczywista przyczyna mutacji w mikrosatelitach jest przedmiotem dyskusji.

Jedną z proponowanych przyczyn takich zmian długości jest poślizg replikacyjny, spowodowany niedopasowaniem między niciami DNA podczas replikacji podczas mejozy. polimeraza DNA , enzym odpowiedzialny za odczyt DNA podczas replikacji, może ześlizgnąć się podczas poruszania się wzdłuż nici matrycy i kontynuować na niewłaściwym nukleotydzie. Poślizg polimerazy DNA jest bardziej prawdopodobny, gdy replikowana jest powtarzalna sekwencja (taka jak CGCGCG). Ponieważ mikrosatelity składają się z takich powtarzających się sekwencji, polimeraza DNA może częściej popełniać błędy w tych regionach sekwencji. Kilka badań wykazało, że poślizg jest przyczyną mutacji mikrosatelitarnych. Zazwyczaj poślizg w każdym mikrosatelitie występuje mniej więcej raz na 1000 pokoleń. Zatem zmiany poślizgu w powtarzalnym DNA są o trzy rzędy wielkości częstsze niż mutacje punktowe w innych częściach genomu. Większość poślizgów skutkuje zmianą tylko jednej powtarzalnej jednostki, a wskaźniki poślizgu różnią się dla różnych długości alleli i rozmiarów jednostek powtórzeń oraz w obrębie różnych gatunków. Jeśli istnieje duża różnica wielkości między poszczególnymi allelami, może wystąpić zwiększona niestabilność podczas rekombinacji w mejozie.

Inną możliwą przyczyną mutacji mikrosatelitarnych są mutacje punktowe, w których tylko jeden nukleotyd jest nieprawidłowo kopiowany podczas replikacji. Badanie porównujące genomy ludzi i naczelnych wykazało, że większość zmian w liczbie powtórzeń w krótkich mikrosatelitach pojawia się raczej w wyniku mutacji punktowych niż poślizgu.

Wskaźniki mutacji mikrosatelitarnych

Szybkości mutacji mikrosatelitarnych różnią się w zależności od pozycji podstawy w stosunku do mikrosatelity, typu powtórzeń i tożsamości zasady. Szybkość mutacji wzrasta wraz z liczbą powtórzeń, osiągając szczyt około sześciu do ośmiu powtórzeń, a następnie ponownie spada. Zwiększona heterozygotyczność w populacji zwiększy również wskaźniki mutacji mikrosatelitarnych, zwłaszcza gdy istnieje duża różnica długości między allelami. Jest to prawdopodobnie spowodowane homologicznymi chromosomami z ramionami o nierównej długości, powodującymi niestabilność podczas mejozy.

Dokonano bezpośrednich szacunków tempa mutacji mikrosatelitarnych w wielu organizmach, od owadów po ludzi. U szarańczy pustynnej Schistocerca gregaria wskaźnik mutacji mikrosatelitarnych oszacowano na 2,1 x 10-4 na pokolenie na locus. Częstość mutacji mikrosatelitarnych w ludzkich męskich liniach zarodkowych jest pięć do sześciu razy wyższa niż w żeńskich liniach zarodkowych i waha się od 0 do 7 x 10-3 na locus na gametę na pokolenie. U nicienia Pristionchus pacificus szacowany wskaźnik mutacji mikrosatelitarnych waha się od 8,9 × 10-5 do 7,5 × 10-4 na locus na pokolenie.

Biologiczne skutki mutacji mikrosatelitarnych

Wiele mikrosatelitów znajduje się w niekodującym DNA i jest biologicznie cichych. Inne umiejscowione są w regulatorowym lub nawet kodującym DNA – mutacje mikrosatelitarne w takich przypadkach mogą prowadzić do zmian fenotypowych i chorób. W badaniu obejmującym cały genom oszacowano, że zmienność mikrosatelitarna odpowiada za 10–15% dziedzicznej zmienności ekspresji genów u ludzi.

Wpływ na białka

U ssaków od 20% do 40% białek zawiera powtarzające się sekwencje aminokwasów kodowane przez krótkie powtórzenia sekwencji. Większość powtórzeń krótkich sekwencji w częściach genomu kodujących białka ma powtarzającą się jednostkę trzech nukleotydów, ponieważ ta długość nie powoduje przesunięć ramek podczas mutacji. Każda powtarzająca się sekwencja trinukleotydów jest przepisywana na powtarzającą się serię tego samego aminokwasu. U drożdży najczęściej powtarzającymi się aminokwasami są glutamina, kwas glutaminowy, asparagina, kwas asparaginowy i seryna.

Mutacje w tych powtarzających się segmentach mogą wpływać na fizyczne i chemiczne właściwości białek, co może powodować stopniowe i przewidywalne zmiany w działaniu białek. Na przykład zmiany długości w tandemowo powtarzających się regionach w genie Runx2 prowadzą do różnic w długości twarzy u psów udomowionych ( Canis familiaris ), z powiązaniem między dłuższymi długościami sekwencji i dłuższymi twarzami. To powiązanie dotyczy również szerszego zakresu gatunków Carnivora. Zmiany długości dróg polialaniny w obrębie genu HoxA13 są powiązane z zespołem ręka-stopa-genitalia , zaburzeniem rozwojowym u ludzi. Zmiany długości innych powtórzeń trypletowych są w szczególności powiązane z ponad 40 chorobami neurologicznymi u ludzi zaburzenia związane z powtórzeniami trinukleotydów, takie jak zespół łamliwego chromosomu X i choroba Huntingtona . Zmiany ewolucyjne wynikające z poślizgu replikacyjnego występują również w prostszych organizmach. Na przykład zmiany długości mikrosatelitów są powszechne w białkach błony powierzchniowej drożdży, zapewniając szybką ewolucję właściwości komórek. W szczególności zmiany długości w genie FLO1 kontrolują poziom adhezji do substratów. Krótkie powtórzenia sekwencji zapewniają również szybkie zmiany ewolucyjne białek powierzchniowych w bakteriach patogennych; może to pozwolić im nadążać za zmianami immunologicznymi u gospodarzy. Zmiany długości w krótkich sekwencjach powtórzeń u grzyba ( Neurspora crassa ) kontrolują czas trwania jego cykli zegara dobowego .

Wpływ na regulację genów

Zmiany długości mikrosatelitów w obrębie promotorów i innych regionów regulatorowych cis mogą szybko zmieniać ekspresję genów między pokoleniami. Ludzki genom zawiera wiele (>16 000) powtórzeń krótkich sekwencji w regionach regulatorowych, które zapewniają „pokrętła dostrajające” ekspresji wielu genów.

Zmiany długości bakteryjnych SSR mogą wpływać na tworzenie fimbrii u Haemophilus influenzae poprzez zmianę odstępów między promotorami. Mikrosatelity dinukleotydowe są powiązane z dużą zmiennością cis-regulatorowych regionów kontrolnych w ludzkim genomie. Mikrosatelity w regionach kontrolnych genu receptora wazopresyny 1a u norników wpływają na ich zachowania społeczne i poziom monogamii.

W mięsaku Ewinga (rodzaj bolesnego raka kości u młodych ludzi) mutacja punktowa stworzyła rozszerzony mikrosatelitę GGAA, który wiąże czynnik transkrypcyjny, który z kolei aktywuje gen EGR2, który napędza raka. Ponadto inne mikrosatelity GGAA mogą wpływać na ekspresję genów, które przyczyniają się do wyników klinicznych pacjentów z mięsakiem Ewinga.

Efekty w obrębie intronów

Mikrosatelity w intronach również wpływają na fenotyp w sposób, który nie jest obecnie rozumiany. Na przykład ekspansja tripletów GAA w pierwszym intronie genu X25 wydaje się zakłócać transkrypcję i powoduje ataksję Friedreicha . Powtórzenia tandemowe w pierwszym intronie genu syntetazy asparaginy są powiązane z ostrą białaczką limfoblastyczną. Powtórzony polimorfizm w czwartym intronie genu NOS3 jest powiązany z nadciśnieniem w populacji tunezyjskiej. Zredukowane długości powtórzeń w genie EGFR są powiązane z kostniakomięsakami.

, że archaiczna forma splicingu zachowana u danio pręgowanego wykorzystuje sekwencje mikrosatelitarne w obrębie intronowego mRNA do usuwania intronów pod nieobecność U2AF2 i innych maszyn splicingowych. Teoretyzuje się, że te sekwencje tworzą wysoce stabilne koniczyny , które zbliżają miejsca składania intronów 3 'i 5', skutecznie zastępując spliceosom . Uważa się, że ta metoda składania RNA odbiegała od ewolucji człowieka podczas tworzenia czworonogów i stanowi artefakt świata RNA .

Efekty w transpozonach

Prawie 50% ludzkiego genomu jest zawarte w różnych typach elementów transpozycyjnych (zwanych także transpozonami lub „skaczącymi genami”), a wiele z nich zawiera powtarzające się DNA. Jest prawdopodobne, że krótkie powtórzenia sekwencji w tych miejscach są również zaangażowane w regulację ekspresji genów.

Aplikacje

Mikrosatelity są wykorzystywane do oceny delecji chromosomalnego DNA w diagnostyce raka. Mikrosatelity są szeroko stosowane do profilowania DNA , znanego również jako „genetyczne pobieranie odcisków palców”, śladów przestępstwa (w kryminalistyce) i tkanek (u pacjentów po przeszczepach). Są również szeroko stosowane w pokrewieństwa (najczęściej w testach na ojcostwo). Ponadto mikrosatelity są wykorzystywane do mapowania lokalizacji w genomie, szczególnie w powiązań genetycznych w celu zlokalizowania genu lub mutacji odpowiedzialnej za daną cechę lub chorobę. Jako szczególny przypadek mapowania, mogą być wykorzystywane do badań lub delecja genu . Naukowcy wykorzystują mikrosatelity w genetyce populacji iw projektach ochrony gatunków. Genetycy roślin zaproponowali wykorzystanie mikrosatelitów do wspomaganej markerami selekcji pożądanych cech w hodowli roślin.

Rozpoznanie raka

W komórkach nowotworowych , których kontrola replikacji jest uszkodzona, mikrosatelity mogą być pozyskiwane lub tracone ze szczególnie wysoką częstotliwością podczas każdej rundy mitozy . Dlatego linia komórek nowotworowych może wykazywać inny genetyczny odcisk palca niż tkanka gospodarza, a zwłaszcza w raku jelita grubego może wykazywać utratę heterozygotyczności . Dlatego mikrosatelity są rutynowo stosowane w diagnostyce raka w celu oceny progresji nowotworu.

Częściowy profil STR człowieka uzyskany przy użyciu zestawu Applied Biosystems Identifiler

Pobieranie odcisków palców w kryminalistyce i medycynie

Analiza mikrosatelitarna stała się popularna w kryminalistyce w latach 90. Jest używany do genetycznego pobierania odcisków palców osób, gdzie pozwala na identyfikację kryminalistyczną (zwykle dopasowując plamę przestępstwa do ofiary lub sprawcy). Jest również używany do obserwacji pacjentów po przeszczepie szpiku kostnego .

Wszystkie mikrosatelity używane obecnie do analizy kryminalistycznej to powtórzenia tetra- lub penta-nukleotydów, ponieważ zapewniają one wysoki stopień bezbłędności danych, a jednocześnie są wystarczająco krótkie, aby przetrwać degradację w nieidealnych warunkach. Nawet krótsze sekwencje powtórzeń miałyby tendencję do występowania artefaktów, takich jak zacinanie się PCR i preferencyjna amplifikacja, podczas gdy dłuższe sekwencje powtórzeń byłyby bardziej narażone na degradację środowiskową i słabiej ulegałyby amplifikacji w PCR . Inną kwestią kryminalistyczną jest prywatność medyczna danej osoby muszą być przestrzegane, tak aby wybrane STR kryminalistyczne były niekodujące, nie wpływają na regulację genów i zwykle nie są trójnukleotydowymi STR, które mogłyby być zaangażowane w choroby związane z ekspansją trojaczków, takie jak choroba Huntingtona . Profile kryminalistyczne STR są przechowywane w bazach danych DNA, takich jak brytyjska Narodowa Baza Danych DNA (NDNAD), amerykański CODIS czy australijski NCIDD.

Analiza pokrewieństwa (testy na ojcostwo)

Mikrosatelity autosomalne są szeroko stosowane do profilowania DNA w analizie pokrewieństwa (najczęściej w testach na ojcostwo). Odziedziczone po ojcu Y-STR (mikrosatelity na chromosomie Y ) są często używane w genealogicznych testach DNA .

Analiza powiązań genetycznych

W latach 90. i kilku pierwszych latach tego tysiąclecia mikrosatelity były markerami genetycznymi koni pociągowych do skanowania całego genomu w celu zlokalizowania dowolnego genu odpowiedzialnego za dany fenotyp lub chorobę, wykorzystując obserwacje segregacji między pokoleniami pobieranego rodowodu . Chociaż wzrost wyższej przepustowości i opłacalnego polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (SNP) doprowadziły do ​​ery SNP do skanowania genomu, mikrosatelity pozostają wysoce informacyjnymi miarami zmienności genomowej do badań powiązań i asocjacji. Ich ciągła zaleta polega na ich większej różnorodności allelicznej niż bialleliczne SNP, dlatego mikrosatelity mogą różnicować allele w ramach interesującego bloku nierównowagi sprzężeń zdefiniowanego przez SNP. Tak więc mikrosatelity z powodzeniem doprowadziły do ​​odkrycia genów cukrzycy typu 2 (TCF7L2) i raka prostaty (region 8q21).

Genetyka populacji

Konsensusowe drzewo łączące sąsiadów 249 populacji ludzkich i sześciu populacji szympansów. Stworzony na podstawie 246 markerów mikrosatelitarnych.

Mikrosatelity zostały spopularyzowane w genetyce populacji w latach 90., ponieważ PCR stał się wszechobecny w laboratoriach, naukowcy byli w stanie zaprojektować startery i amplifikować zestawy mikrosatelitów przy niskich kosztach. Ich zastosowania są bardzo szerokie. Mikrosatelita o neutralnej historii ewolucyjnej sprawia, że ​​nadaje się do pomiaru lub wnioskowania o wąskich gardłach , lokalnej adaptacji , wskaźniku fiksacji alleli (FST ) , wielkości populacji i przepływu genów . Jako sekwencjonowanie nowej generacji staje się bardziej przystępny cenowo, wykorzystanie mikrosatelitów zmniejszyło się, jednak pozostają one kluczowym narzędziem w tej dziedzinie.

Rozmnażanie roślin

Selekcja wspomagana markerem lub selekcja wspomagana markerem (MAS) to proces selekcji pośredniej, w którym cecha będąca przedmiotem zainteresowania jest wybierana na podstawie markera ( zmiany morfologiczne , biochemiczne lub DNA / RNA ) powiązanego z cechą będącą przedmiotem zainteresowania (np. produktywność, odporność na choroby, stres tolerancji i jakości), a nie samej cechy. Zaproponowano wykorzystanie mikrosatelitów jako takich markerów wspomagających hodowlę roślin.

Analiza

Analiza krótkich powtórzeń tandemowych (STR) na uproszczonym modelu z wykorzystaniem reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR): Najpierw próbka DNA poddawana jest PCR ze starterami ukierunkowanymi na określone STR (które różnią się długością u poszczególnych osobników i ich alleli ). Otrzymane fragmenty rozdziela się według wielkości (np. elektroforeza ).

Powtarzające się DNA nie jest łatwe do analizy za pomocą metod sekwencjonowania DNA nowej generacji , które zmagają się z homopolimerowymi traktami. Dlatego mikrosatelity są zwykle analizowane za pomocą konwencjonalnej amplifikacji PCR i określania wielkości amplikonu, po którym czasami następuje sekwencjonowanie DNA Sangera .

W kryminalistyce analizę przeprowadza się poprzez ekstrakcję jądrowego DNA z komórek próbki będącej przedmiotem zainteresowania, a następnie amplifikację określonych regionów polimorficznych wyekstrahowanego DNA za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy . Po zamplifikowaniu tych sekwencji są one rozdzielane za pomocą elektroforezy żelowej lub elektroforezy kapilarnej , co pozwoli analitykowi określić, ile jest powtórzeń danej sekwencji mikrosatelitów. Jeśli DNA zostało rozdzielone za pomocą elektroforezy żelowej, DNA można uwidocznić za pomocą barwienia srebrem (niska czułość, bezpieczny, niedrogi) lub barwnik interkalujący, taki jak bromek etydyny (dość czuły, umiarkowane zagrożenie dla zdrowia, niedrogi) lub, jak większość nowoczesnych laboratoriów kryminalistycznych, barwniki fluorescencyjne (wysoce czułe, bezpieczne, drogie). Instrumenty zbudowane w celu rozdzielania fragmentów mikrosatelitarnych za pomocą elektroforezy kapilarnej również wykorzystują barwniki fluorescencyjne. Profile kryminalistyczne są przechowywane w głównych bankach danych. Brytyjska baza danych do identyfikacji loci mikrosatelitarnych była pierwotnie oparta na brytyjskim systemie SGM+ wykorzystującym 10 loci i marker płci . Amerykanie zwiększyli tę liczbę do 13 loci. Australijska baza danych nosi nazwę NCIDD i od 2013 roku wykorzystuje do profilowania DNA 18 markerów rdzeniowych.

Wzmocnienie

Mikrosatelity można amplifikować w celu identyfikacji w procesie reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), stosując unikalne sekwencje regionów flankujących jako startery . DNA jest wielokrotnie denaturowany w wysokiej temperaturze w celu oddzielenia podwójnej nici, a następnie schładzany, aby umożliwić hybrydyzację starterów i wydłużanie sekwencji nukleotydowych przez mikrosatelitę. Proces ten prowadzi do wytworzenia wystarczającej ilości DNA, aby był widoczny na agarozie lub poliakryloamidzie żele; do amplifikacji potrzebne są tylko niewielkie ilości DNA, ponieważ w ten sposób termocykling powoduje wykładniczy wzrost replikowanego segmentu. Dzięki obfitości technologii PCR startery flankujące loci mikrosatelitarne są proste i szybkie w użyciu, ale opracowanie prawidłowo działających starterów jest często żmudnym i kosztownym procesem.

Szereg próbek DNA z próbek Littorina plena zamplifikowano przy użyciu reakcji łańcuchowej polimerazy ze starterami ukierunkowanymi na locus zmiennego prostego powtórzenia sekwencji (SSR, inaczej mikrosatelitarny). Próbki prowadzono na 5% żelu poliakryloamidowym i wizualizowano za pomocą barwienia srebrem.

Projektowanie starterów mikrosatelitarnych

W przypadku poszukiwania markerów mikrosatelitarnych w określonych regionach genomu, na przykład w określonym intronie , startery można zaprojektować ręcznie. Obejmuje to przeszukiwanie sekwencji genomowego DNA pod kątem powtórzeń mikrosatelitarnych, co można zrobić naocznie lub za pomocą zautomatyzowanych narzędzi, takich jak maskowanie powtórzeń . Po określeniu potencjalnie użytecznych mikrosatelitów, sekwencje flankujące można wykorzystać do zaprojektowania oligonukleotydowych , które będą amplifikować specyficzne powtórzenie mikrosatelitarne w reakcji PCR.

Losowe startery mikrosatelitarne można opracować przez klonowanie losowych segmentów DNA z gatunków ogniskowych. Te losowe segmenty są wstawiane do plazmidu lub wektora bakteriofagowego , który z kolei jest wszczepiany do bakterii Escherichia coli . Następnie rozwija się kolonie i przesiewa za pomocą oligonukleotydu znakowanego fluorescencyjnie sekwencje, które będą hybrydyzować z powtórzeniem mikrosatelitarnym, jeśli jest obecne w segmencie DNA. Jeśli za pomocą tej procedury można uzyskać pozytywne klony, DNA jest sekwencjonowane, a startery do PCR są wybierane z sekwencji flankujących takie regiony w celu określenia określonego locus . Proces ten wymaga znacznych prób i błędów ze strony badaczy, ponieważ należy przewidzieć sekwencje powtórzeń mikrosatelitarnych, a losowo izolowane startery mogą nie wykazywać znaczącego polimorfizmu. Loci mikrosatelitarne są szeroko rozpowszechnione w genomie i można je izolować z częściowo zdegradowanego DNA starszych próbek, ponieważ wszystko, czego potrzeba, to odpowiedni substrat do amplifikacji metodą PCR.

Nowsze techniki obejmują stosowanie sekwencji oligonukleotydów składających się z powtórzeń komplementarnych do powtórzeń w mikrosatelitie w celu „wzbogacenia” wyekstrahowanego DNA ( wzbogacenie mikrosatelitarne ). Sonda oligonukleotydowa hybrydyzuje z powtórzeniem w mikrosatelitie, a następnie kompleks sonda/mikrosatelita jest wyciągany z roztworu. Wzbogacone DNA jest następnie klonowane jak zwykle, ale odsetek sukcesów będzie teraz znacznie wyższy, drastycznie skracając czas potrzebny do opracowania regionów do użytku. Jednak to, które sondy należy zastosować, może być samo w sobie procesem prób i błędów.

ISSR-PCR

ISSR (dla powtórzenia sekwencji między prostymi ) to ogólne określenie regionu genomu między loci mikrosatelitarnymi. Sekwencje komplementarne do dwóch sąsiednich mikrosatelitów są używane jako startery PCR; region zmienny między nimi zostaje wzmocniony. Ograniczona długość cykli amplifikacji podczas PCR zapobiega nadmiernej replikacji zbyt długich ciągłych sekwencji DNA, więc wynikiem będzie mieszanka różnych zamplifikowanych nici DNA, które są na ogół krótkie, ale różnią się znacznie długością.

Sekwencje zamplifikowane metodą ISSR-PCR można wykorzystać do pobierania odcisków palców DNA. Ponieważ ISSR może być regionem konserwatywnym lub niekonserwowanym, technika ta nie jest przydatna do rozróżniania osobników, ale raczej do filogeograficznych lub być może wyznaczania granic gatunków ; różnorodność sekwencji jest mniejsza niż w SSR-PCR, ale wciąż wyższa niż w rzeczywistych sekwencjach genów. Ponadto sekwencjonowanie mikrosatelitarne i sekwencjonowanie ISSR wzajemnie się wspomagają, ponieważ jedno wytwarza startery dla drugiego.

Ograniczenia

Powtarzające się DNA nie jest łatwe do analizy za pomocą metod sekwencjonowania DNA nowej generacji , które zmagają się z homopolimerowymi traktami. Dlatego mikrosatelity są zwykle analizowane za pomocą konwencjonalnej amplifikacji PCR i określania wielkości amplikonu. Zastosowanie PCR oznacza, że ​​analiza długości mikrosatelitarnej jest podatna na ograniczenia PCR, jak każde inne locus DNA amplifikowane przez PCR. Szczególnym problemem jest występowanie „ alleli zerowych ”:

  • Czasami, w próbce osób, na przykład w przypadku testów na ojcostwo, mutacja w DNA otaczającym mikrosatelitę może uniemożliwić związanie startera PCR i wytworzenie amplikonu (tworzenie „allelu zerowego” w teście żelowym), a więc tylko jeden allel jest amplifikowany (z niezmutowanego chromosomu siostrzanego), a osobnik może wtedy fałszywie wyglądać na homozygotę. Może to powodować zamieszanie w sprawach dotyczących ojcostwa. Może być wówczas konieczne zamplifikowanie mikrosatelity przy użyciu innego zestawu starterów. Allele zerowe są spowodowane zwłaszcza przez mutacje w sekcji 3', gdzie rozpoczyna się wydłużanie.
  • W analizie gatunków lub populacji, na przykład w pracach konserwatorskich, startery PCR, które amplifikują mikrosatelity u jednego osobnika lub gatunku, mogą działać u innych gatunków. Jednak ryzyko zastosowania starterów PCR w różnych gatunkach polega na tym, że allele zerowe stają się prawdopodobne, gdy rozbieżność sekwencji jest zbyt duża, aby startery mogły się związać. Gatunek może wtedy sztucznie wydawać się mieć zmniejszoną różnorodność. Allele zerowe w tym przypadku mogą czasami wskazywać na nadmierną częstość homozygot powodujących odchylenia od oczekiwań równowagi Hardy'ego-Weinberga.

Zobacz też

Dalsza lektura

Linki zewnętrzne

Pobrano z „ https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Microsatellite&oldid=1142666996 ”