Spizellomyces punctatus

Spizellomyces punctatus
Klasyfikacja naukowa
Królestwo:	Grzyby
Dział:	Chytridiomycota
Klasa:	Chytridiomycetes
Zamówienie:	Spizellomycetales
Rodzina:	Spizellomycetaceae
Rodzaj:	Spizellomyces
Gatunek:	S. punctatus
Nazwa dwumianowa
Spizellomyces punctatus (WJ Koch) DJS Barr

Spizellomyces punctatus to grzyb chytrid żyjący w glebie. Jest to saprotroficzny grzyb kolonizujący rozkładający się materiał roślinny. Będąc wczesnym grzybem rozbieżnym , S. punctatus zachowuje cechy komórkowe przodków, które występują również u zwierząt i ameb . Jego patogenni krewni, Batrachochytrium dendrobatidis i B. salamandrivorans , zakażają płazy i powodują globalną utratę różnorodności biologicznej . Czysta kultura S. punctatus został po raz pierwszy uzyskany przez Kocha (nazwany Phlyctochytrium punctatum ).

Genom

Genom szczepu S. punctatus DAOM BR117 został zsekwencjonowany w ramach projektu Origins of Multicellularity. Jego rozmiar genomu wynosi około 24,13 Mb przy zawartości GC 47,6%. Genom ma 9424 przewidywanych transkryptów i 8952 przewidywanych genów kodujących białka . Numer dostępu DDBJ/EMBL/GenBank to ACOE00000000.

Transformacja genetyczna

Transformacja za pośrednictwem Agrobacterium

Udało się przeprowadzić transformację genetyczną zoospor S. punctatus przez patogen roślinny Agrobacterium tumefaciens szczep EHA105. Przetestowano kilka markerów selekcyjnych. Wzrost S. punctatus nie jest hamowany przez genetycynę (G418), puromycynę i fleomycynę D10 (zeocynę) do 800 mg/l. 200 mg/l higromycyny i 800 mg/l nourseothricin (CloNAT) całkowicie hamują S. punctatus wzrost. Naukowcy, którzy opracowują ten protokół, używają higromycyny jako markera selekcyjnego. S. punctatus HSP70 i H2B kierują wystarczającą ekspresją genów dla oporności na higromycynę i ekspresji GFP testowanej na drożdżach. Jednak kontrolowany przez silniejszy H2B , GFP może nie zostać pomyślnie zwinięty w S. punctatus . Inne białka fluorescencyjne, w tym tdTomato, mClover3, mCitrine i mCerulean3, są funkcjonalne w S. punctatus.

Elektroporacja

Opracowano również protokół wysokowydajnej elektroporacji dla S. punctatus i dwóch pokrewnych gatunków chytridów, B. dendrobatidis i B. salamandrivorans . Optymalne napięcie dla S. punctatus wynosi 1000 V. Wydajność wynosi około 95% przy użyciu zsynchronizowanych zoospor. Elektroporacja przy użyciu niezsynchronizowanych zoosporów może również osiągnąć wydajność ponad 80%.

Koło życia

S.punctatus (3–5 mm) nie mają ściany komórkowej . Zoospory mogą pływać z ruchomą rzęską (20–24 mm) lub pełzać po powierzchni przez wypełnione aktyną nibynóżki .

Podczas otorbienia rzęska jest najpierw rozkładana poprzez internalizację aksonemu . Inicjacja tego procesu jest zależna od aktyny. Aksonem pozostaje nienaruszony podczas internalizacji, a tubulina aksonalna jest przynajmniej częściowo rozkładana przez proteasom . Ściana komórkowa powstaje po internalizacji aksonemu. S. punctatus występuje pięć trybów internalizacji aksonemu : odcinanie, zawijanie w retrakcji, retrakcja z biczem, retrakcja utraty przedziału rzęskowego i retrakcja pęcherzykowa. Po pierwsze, odcięcie jest określane jako odłączenie rzęski. Po drugie, zataczanie się w retrakcji jest równoczesne z rotacją korową lub bez niej i jest określane odpowiednio jako retrakcja skrętu ciała i retrakcja prosta. Po trzecie, podczas wycofywania rzęs, rzęska owija się na zewnątrz zoospory, łącząc błonę rzęskową i błonę plazmatyczną. hydrożelach pokrytych fibronektyną 120 kPa , to wycofywanie się następuje w ciągu sekundy. Po czwarte, w celu wycofania utraty przedziału rzęskowego, po ekspansji błony rzęskowej następuje połączenie przedziału rzęskowego z błoną plazmatyczną. Po piąte, retrakcja pęcherzykowa polega na utworzeniu wybrzuszenia pętli aksonemicznej w błonie rzęskowej przed internalizacją.

Po cofnięciu rzęski torbiel kiełkuje i wytwarza rurkę zarodkową . Rurka zarodkowa jest następnie wydłużana, tworząc system ryzoidalny. W końcu cysta rozwija się w zarodnię , strukturę reprodukcyjną i rozpoczyna się mitoza . Po pięciu do ośmiu synchronicznych mitozach w zarodni tworzy się od 32 do 256 zoospor. Ciliogeneza prawdopodobnie zachodzi przed komórkowaniem. Po komórkowaniu zoospory uciekają ze sporangium w odpowiednich warunkach środowiskowych.

Czas cyklu komórkowego określono ilościowo przy użyciu S. punctatus wyrażającego H2B-TdTomato kontrolowanego przez promotor H2B pod mikroskopem. Cofnięcie rzęski i początek otorbienia następuje w ciągu jednej godziny. Rurka zarodkowa pojawia się w ciągu jednej do trzech godzin. Pierwsza mitoza ma miejsce w ciągu ośmiu do dwunastu godzin. Kończy pięć do ośmiu razy synchronicznej mitozy w ciągu trzydziestu godzin. Przeciętny cykl komórkowy trwa około 150 minut. Każdy podział jądrowy jest ukończony w ciągu 1 minuty.

Edycja mitochondrialnego 5' tRNA

Gatunek ten wyróżnia się redagowaniem mitochondrialnego 5′ tRNA , rzadką modyfikacją, o której wiadomo, że występuje również w gatunkach Amoebozoa Acanthamoeba castellanii i Chytridiomycota Harpochytrium 94, Harpochytrium 105, Monoblepharella 15 i Hyaloraphidium curvatum . Genom mitochondrialny S. punctatus koduje osiem tRNA rozpoznających lizynę , kwas asparaginowy , tryptofan , metioninę , kodony tyrozyny , glutaminy , proliny i leucyny . tRNA ^{Leu rozpoznaje} kodon UAG jako leucynę zamiast kodonu stop.

tRNA tworzą struktury drugorzędowe, które składają się ze spiralnych łodyg. Przewiduje się na podstawie mtDNA , że niedopasowania występują w pierwszych trzech nukleotydach ośmiu pni akceptorowych tRNA. Sekwencjonowanie dojrzałych mitochondrialnych tRNA wykazało zastąpienie pirymidyn lub puryn purynami (A do G, U do G, U do A i C do A), które przywracają parowanie zasad. Strony edycji są zawsze ograniczone do pierwszych trzech pozycji.

Edycja mitochondrialnego 5' tRNA S. punctatus została potwierdzona in vitro. Używając ekstraktu mitochondrialnego, niedopasowania 5' syntetycznych transkryptów tRNA są usuwane, a nukleotydy są włączane w kierunku od 3' do 5' przy użyciu sekwencji 3' tRNA jako matryc. Wzory edycji mitochondrialnego 5' tRNA są podobne do tych występujących u A. castellanii.

Homologi receptora fitohormonu

Receptory etylenowe i cytokininowe u roślin to kinazy histydynowe . Kinazy histydynowe u grzybów są hybrydowymi kinazami histydynowymi ze względu na fuzję ATPazy typu kinazy histydynowej / kinazy histydynowej (domeny HK / HATPazy) z domeną odbiorczą. Homologi receptora etylenu i cytokininy znajdują się również w kilku rodzajach grzybów wiciowych i niewiciowych, w tym Spizellomyces . Ogólnie rzecz biorąc, te dwa fitohormony są cząsteczkami sygnałowymi w interakcjach biotycznych roślin. Receptory etylenu i cytokininy we wczesnych grzybach dywersyfikujących mogą odgrywać ważną rolę w kolonizacji ziemi.

Opsy

Istnieją dwa typy opsyny: opsyny typu 1 są wykorzystywane przez prokarioty i niektóre algi (jako składnik rodopsyn kanałowych ) oraz grzyby , podczas gdy opsyny typu 2 wykorzystywane są przez zwierzęta . Opsyny typu 2 należą do rodziny z białkiem G klasy A. Oba typy są receptorami siedmiotransbłonowymi i wiążą kowalencyjnie siatkówkę jako chromofor, co zamienia je w fotoreceptory wyczuwające światło. Jednak oba typy nie są powiązane na poziomie sekwencji.

W innych grzybach, takich jak Blastocladiella emersonii , wiciowiec wcześnie rozbieżny, opsyny typu 1 są używane do fototaksji . Jednak w S. punctatus opsy typu 1 nie istnieją, ale istnieje przypuszczalna opsyna typu 2. Dzieli z innymi receptorami sprzężonymi z białkiem G szereg konserwatywnych motywów i aminokwasów, w tym lizynę odpowiadającą reszcie 296 rodopsyny bydlęcej, która jest ważna dla wiązania siatkówki i wyczuwania światła. Jest to sugerowane przez modelowanie struktury oparte na szablonach, również strukturalnie podobne do opsów zwierzęcych typu 2. Przynajmniej obliczeniowo może wiązać siatkówkę jako chromofor. Jednak preferuje wiązanie 9-cis-retinalu, w przeciwieństwie do większości klasycznych zwierzęcych opsyn typu 2, takich jak rodopsyna bydlęca , która wiąże 11-cis-retinal w stanie ciemnym. Jednak funkcja biologiczna S. punctatus opsin jest nieznany. Nie jest również jasne, czy rzeczywiście jest to opsyna typu 2, ponieważ nie ma jej w kompleksowej pyhlogenezie opsyny, która obejmuje jak najwięcej opsyny. Zasadniczo, jeśli jest to fotoreceptor, mógł niezależnie wyewoluować wrażliwość na światło.