Test dyfuzji dysku

W laboratoriach diagnostycznych krążkowy test dyfuzyjny służy do określania wrażliwości izolatów klinicznych bakterii na różne antybiotyki. Skuteczny antybiotyk wytworzy dużą strefę zahamowania wzrostu (krążek C), podczas gdy nieskuteczny antybiotyk może w ogóle nie wpływać na wzrost bakterii (krążek A). Antybiotyki, na które izolat bakteryjny jest częściowo wrażliwy, wytwarzają strefę zahamowania wzrostu o średniej wielkości (krążek B).

W laboratoriach zajmujących się odkrywaniem leków test dyfuzji krążkowej służy do badania ekstraktów produktów naturalnych pod kątem działania przeciwbakteryjnego. Ekstrakty o działaniu przeciwbakteryjnym, na przykład powyższe ekstrakty z eteru naftowego, chloroformu, etanolu i acetonu, utworzą strefę inhibicji.

Test dyfuzji krążka ( znany również jako test dyfuzji agarowej , test Kirby-Bauera , test wrażliwości na antybiotyki z krążkiem dyfuzyjnym , test wrażliwości na antybiotyk z krążkiem dyfuzyjnym i test KB ) to oparty na hodowli test mikrobiologiczny stosowany w laboratoriach diagnostycznych i odkrywania leków . W laboratoriach diagnostycznych test służy do określania wrażliwości bakterii wyizolowanych z zakażenia pacjenta na klinicznie zatwierdzone antybiotyki. Pozwala to lekarzom na przepisanie najodpowiedniejszego leczenia antybiotykami. W laboratoriach zajmujących się odkrywaniem leków, zwłaszcza zajmujących się poszukiwaniem biologicznym , test jest używany do przeszukiwania materiału biologicznego (np. ekstraktów roślinnych, bakteryjnego bulionu fermentacyjnego) i kandydatów na leki pod kątem aktywności przeciwbakteryjnej. Podczas bioprospekcji test można przeprowadzić na sparowanych szczepach bakterii, aby uzyskać dereplikację i tymczasowo zidentyfikować mechanizm działania przeciwbakteryjnego .

W laboratoriach diagnostycznych badanie wykonuje się poprzez zaszczepienie powierzchni płytki agarowej bakteriami wyizolowanymi z zakażenia pacjenta. Krążki papierowe zawierające antybiotyk są następnie nakładane na agar i płytka jest inkubowana. Jeśli antybiotyk powstrzyma wzrost bakterii lub zabije bakterie , wokół dysku pojawi się obszar, w którym bakterie nie urosną na tyle, aby były widoczne. Nazywa się to strefą zahamowania. Wrażliwość izolatu bakteryjnego na każdy antybiotyk można następnie oszacować częściowo, porównując rozmiar tych stref zahamowania z bazami danych zawierającymi informacje o znanych bakteriach wrażliwych na antybiotyki, średnio wrażliwych i opornych. W ten sposób możliwe jest zidentyfikowanie najbardziej odpowiedniego antybiotyku do leczenia infekcji pacjenta. Chociaż testu dyfuzyjnego krążka nie można stosować do różnicowania aktywności bakteriostatycznej i bakteriobójczej, jest on mniej kłopotliwy niż inne metody oznaczania wrażliwości, takie jak rozcieńczanie bulionu .

W laboratoriach zajmujących się odkrywaniem leków test dyfuzji dysku jest wykonywany nieco inaczej niż w laboratoriach diagnostycznych. W tym przypadku nie należy charakteryzować szczepu bakteryjnego, ale badany ekstrakt (np. ekstrakt roślinny lub bakteryjny). Płytkę agarową zaszczepia się zatem szczepem bakteryjnym o znanym fenotypie (często ATCC lub NCTC ), a na powierzchnię nakłada się krążki zawierające badany ekstrakt. Strefa wielkości inhibicji nie może być stosowana jako półilościowa miara siły działania przeciwbakteryjnego, ponieważ różne ekstrakty zawierają cząsteczki o różnej charakterystyce dyfuzyjnej (różna wielkość cząsteczek , hydrofilowość itp.). Strefa wielkości hamowania może być jednak wykorzystana do dereplikacji. Osiąga się to poprzez testowanie każdego ekstraktu na parach szczepów bakterii (np. szczepy wrażliwe i oporne na streptomycynę w celu identyfikacji ekstraktów zawierających streptomycynę). Sparowane szczepy (np. szczepy typu dzikiego i docelowe szczepy nadeksprymujące) można również wykorzystać do zidentyfikowania przeciwbakteryjnego mechanizmu działania.

Historia

Dyfuzja agarowa została po raz pierwszy zastosowana przez Martinusa Beijerincka w 1889 roku do zbadania wpływu auksyn na wzrost bakterii. Jednak metoda ta była przez lata rozwijana, udoskonalana i standaryzowana przez wielu naukowców i organizacje naukowe, w tym George'a F. Reddisha, Normana Heatleya , Jamesa G. Vincenta, Alfreda W. Bauera, Williama MM Kirby'ego, Johna C. Sherrisa , Hansa Martina Ericsson, Światowa Organizacja Zdrowia , Instytut Standardów Klinicznych i Laboratoryjnych , Szwedzka Grupa Referencyjna ds. Antybiotyków, Deutsches Institut für Normung , Brytyjskie Towarzystwo Chemioterapii Przeciwdrobnoustrojowej i inne.

Zasada

Czystą hodowlę bakteryjną zawiesza się w roztworze soli fizjologicznej, standaryzuje się jej zmętnienie i równomiernie rozmazuje się po płytce agarowej. Następnie na powierzchni agaru umieszcza się krążek bibuły filtracyjnej nasycony antybiotykiem lub ekstraktem. Składnik(i) krążka dyfunduje z bibuły filtracyjnej do agaru. Stężenie tych składników będzie najwyższe w pobliżu dysku i będzie malało wraz ze wzrostem odległości od dysku. Jeśli antybiotyk lub ekstrakt jest skuteczny przeciwko bakteriom w określonym stężeniu, żadne kolonie nie będą rosły tam, gdzie stężenie w agarze jest większe lub równe stężeniu skutecznemu. To jest strefa zahamowania. Ogólnie rzecz biorąc, większe strefy inhibicji korelują z niższymi minimalnymi stężeniami hamującymi (MIC) antybiotyku lub ekstraktu dla danego szczepu bakterii. Wyjątkiem są sytuacje, w których cząsteczki antybiotyku lub ekstraktu są duże lub hydrofobowe, ponieważ powoli dyfundują przez agar.

Metoda standardowa

Standardowe testy Kirby-Bauera: białe krążki zawierające antybiotyki pokazane na płytce agarowej z bakteriami. Okrągłe strefy słabego wzrostu bakterii otaczają niektóre krążki, co wskazuje na wrażliwość na antybiotyk.

Przygotowanie płytki agarowej i inokulum

Wszystkie aspekty procedury Kirby-Bauera są wystandaryzowane, aby zapewnić spójne i dokładne wyniki. Z tego powodu laboratorium musi przestrzegać tych standardów. Pożywką stosowaną w teście Kirby-Bauer musi być agar Muellera-Hintona o głębokości zaledwie 4 mm, wylany na szalki Petriego o średnicy 100 mm lub 150 mm. Poziom pH agaru musi wynosić od 7,2 do 7,4 . Inokulum bakteryjne przygotowuje się przez rozcieńczenie hodowli bulionowej w celu dopasowania do standardu zmętnienia 0,5 McFarlanda , co odpowiada około 150 milionom komórek na ml.

Inokulacja i inkubacja

Stosując technikę aseptyczną , hodowlę bulionową określonego organizmu pobiera się sterylnym wacikiem . W przypadku bakterii Gram-ujemnych nadmiar płynu usuwa się z wymazówki delikatnie dociskając lub obracając ją do wnętrza probówki. Wymaz jest następnie rozsmarowywany na płytce agarowej Muellera-Hintona w celu utworzenia trawnika bakteryjnego. Aby uzyskać równomierny wzrost, płytkę agarową posmarowuje się wacikiem w jednym kierunku, obraca o 120° i ponownie posiewa, obraca o kolejne 120° i ponownie posiewa. Za pomocą dozownika krążków z antybiotykiem na płytkę nakłada się krążki zawierające określone antybiotyki. Należy to zrobić w ciągu 15 minut od zaszczepienia. Do delikatnego dociśnięcia każdego krążka do agaru i upewnienia się, że jest przymocowany, używa się wysterylizowanych w płomieniu kleszczyków. Płytki następnie inkubuje się przez noc, zwykle w temperaturze 35°C. Płytki należy inkubować w ciągu 15 minut od nałożenia krążków z antybiotykiem.

Alternatywne metody

Opracowano kilka odmian metody dyfuzji krążkowej, w tym kubeczek penicylinowy Oxford i metody Etest stosowane w szpitalnych laboratoriach diagnostycznych oraz metody dyfuzji studzienkowej, dyfuzji cylindrycznej i bioautografii stosowane w laboratoriach odkrywania i opracowywania leków.

Metoda kubka z penicyliną Oxford

Krążki zawierające wzrastające stężenia antybiotyków umieszcza się na zasianym trawniku bakteryjnym na powierzchni agaru i płytki poddaje się inkubacji. Rozmiary stref są mierzone od krawędzi dysku do końca wolnej strefy. Interpretacja jest bardziej skomplikowana w populacjach o mieszanej podatności. Są one wykreślane jako wymiary liniowe lub kwadraty odległości jako funkcja logarytmu naturalnego stężenia antybiotyku w krążkach. Wartość MIC jest określana na podstawie punktu przecięcia zera regresji liniowej z dopasowaniem danych. Samo przecięcie jest logarytmem MIC. Nachylenie linii regresji jest związane ze współczynnikiem dyfuzji danego antybiotyku w agarze.

Inne obrazy

Dyfuzja agarowa została po raz pierwszy zastosowana w 1889 roku przez Martinusa Beijerincka .
Zbliżenie na wyniki testu dyfuzyjnego agaru.
Antybiogram Serratia marcescens . Każdy krążek jest oznaczony antybiotykiem, który zawiera (np. AMC30, 30 µg amoksycyliny z kwasem klawulanowym )

Zobacz też