Mikrobiologia diagnostyczna
Mikrobiologia diagnostyczna to nauka o identyfikacji drobnoustrojów. Od czasu odkrycia teorii zarazków , naukowcy znajdują sposoby na zbieranie określonych organizmów. Korzystając z metod, takich jak media różnicowe lub sekwencjonowanie genomu , lekarze i naukowcy mogą obserwować nowe funkcje organizmów w celu skuteczniejszej i dokładniejszej diagnozy organizmów. Metody stosowane w mikrobiologii diagnostycznej są często stosowane w celu wykorzystania szczególnej różnicy między organizmami i uzyskania informacji o tym, do jakiego gatunku można je zidentyfikować, co często odbywa się poprzez odniesienie do wcześniejszych badań. Nowe badania dostarczają informacji, do których inni mogą się odwoływać, aby naukowcy mogli uzyskać podstawową wiedzę na temat badanego organizmu.
Aerobowy kontra beztlenowy
Organizmy beztlenowe wymagają środowiska beztlenowego. Podczas hodowli drobnoustrojów beztlenowych buliony są często przepłukiwane gazowym azotem w celu wygaszenia obecnego tlenu, a wzrost może również zachodzić na pożywkach w komorze bez tlenu. Można dodać resazurynę sodową, aby wskazać redoks . Hodowle należy inkubować w środowisku beztlenowym przez 48 godzin w temperaturze 35 °C przed zbadaniem wzrostu.
Gromadzenie bakterii beztlenowych może pochodzić z różnych źródeł w próbkach pacjentów, w tym z krwi, żółci, szpiku kostnego, płynu mózgowo-rdzeniowego , bezpośredniej aspiracji płuc, biopsji tkanek z normalnie sterylnego miejsca, płynu z normalnie sterylnego miejsca (np. , ropień, ropień brzucha lub miednicy, nóż, postrzał lub rana chirurgiczna lub ciężkie oparzenia.
Długość inkubacji
Czasy inkubacji różnią się w zależności od drobnoustroju, który wymaga hodowli. Na przykład tradycyjne techniki hodowli wymagają mniej niż 24 godzin czasu hodowli Escherichia coli , ale 6–8 tygodni do udanej hodowli Mycobacterium tuberculosis , zanim zostaną wyrażone ostateczne wyniki. Zaletą testów bez hodowli jest to, że lekarze i mikrobiolodzy nie są upośledzeni przez okresy oczekiwania.
Inkubacja przebiega zgodnie ze zmienną krzywej wzrostu dla każdego mikroorganizmu. Kultury przechodzą przez fazę opóźnienia, logarytmu, stacjonarności i ostatecznie śmierci. Faza zastoju nie jest dobrze znana w mikrobiologii, ale spekuluje się, że faza ta polega na dostosowaniu się mikroorganizmu do środowiska poprzez syntezę białek specyficznych dla otaczającego środowiska. Faza logarytmiczna to okres, w którym kultura doświadcza logarytmicznego wzrostu, dopóki składniki odżywcze nie staną się rzadkie. Faza stacjonarna to moment, w którym stężenie kultury jest najwyższe i komórki przestają się rozmnażać. Kiedy składniki odżywcze w środowisku wyczerpują się, organizmy wchodzą w fazę śmierci, w której toksyczne metabolity stają się obfite, a składniki odżywcze są wyczerpane do punktu, w którym śmierć komórki przewyższa reprodukcję.
Szybka identyfikacja po hodowli
Zautomatyzowane systemy hodowli
Automatyczne systemy do hodowli komórkowych stają się popularne ze względu na ich zdolność do utrzymywania sterylnego środowiska wzrostu i odciążenia personelu laboratoryjnego związanego z powtarzalnymi eksperymentami. Laboratoria mogą również ustawić czasy inkubacji, aby dostosować je do okresu opóźnienia związanego ze wzrostem bakterii.
Posiewy krwi
Posiewy krwi mogą pozwolić na wyniki diagnostyczne po hodowli. Niedawny rozwój PCR opartej na DNA zapewnił szybsze wyniki diagnostyczne w przeciwieństwie do nocnych testów biochemicznych. Test diagnostyczny DNA może diagnozować z prawie taką samą specyficznością jak test biochemiczny, dając taki sam wynik diagnostyczny w 90% przypadków.
Testy oddechowe
Test oddechowy do diagnostyki mikrobiologicznej u pacjentów był stosowany w warunkach klinicznych dla bakterii, w tym Helicobacter pylori . Test diagnostyczny z wykorzystaniem oddechu pacjenta poszukuje wydalanych metabolitów, które zostały wytworzone przez zakaźny mikroorganizm. H. pylori bada się, badając pacjentów pod kątem stężenia CO 2 , podwyższonego ze względu na zdolność organizmu do przekształcania mocznika w inne pochodne.
Konwencjonalne testy
Wykrywanie przeciwciał
Zaletą wykrywania przeciwciał ( ELISA ) jest to, że identyfikacja białka na mikroorganizmie jest szybsza niż metoda Western blot . Wykrywanie przeciwciał polega na dołączeniu wskaźnika do przeciwciała o znanej specyficzności i obserwowaniu, czy przeciwciało się przyłącza. Test ELISA może również wskazywać obecność wirusów i jest wysoce swoisty, ze specyficznością wykrywania 10-9-10-12 moli na litr wykrywania. Znając epitopu przeciwciała, test ELISA można również zastosować do wykrywania antygenu w próbce.
Wykrywanie i kultura histologiczna
histologiczne stosowane w mikrobiologii są przydatne ze względu na ich zdolność do szybkiej identyfikacji choroby obecnej w biopsji tkanki .
Szybkie testy antygenowe
Immunofluorescencja
Immunofluorescencja jest przeprowadzana przez wytwarzanie przeciwciał z przyłączoną cząsteczką fluorescencyjną, co czyni ją cząsteczką chemiluminescencyjną , która zapewnia blask pod wpływem światła ultrafioletowego. Przeciwciała dodaje się do roztworu bakteryjnego, dostarczając antygen do wiązania przylegania fluorescencyjnego przeciwciała.
Spekrtometria masy
MALDI-TOF ( ang. Matrix-assisted laser desorption/ionization - time of flight) to specyficzny rodzaj spektrometrii mas , który jest w stanie zidentyfikować mikroorganizmy. Czysta kultura jest izolowana i rozprowadzana bezpośrednio na tarczy ze stali nierdzewnej lub jednorazowego użytku. Komórki są lizowane i pokrywane macierzą, która tworzy kompleksy białkowe z białkami bakteryjnymi. MALDI wystrzeliwuje laser i jonizuje kompleksy białkowe, które odrywają się i przemieszczają w górę próżni, gdzie są wykrywane na podstawie masy i ładunku. Otrzymane widma białek są porównywane ze znaną bazą danych skatalogowanych wcześniej organizmów, co skutkuje szybką diagnozą mikroorganizmów. Ostatnie badania sugerują, że testy te mogą stać się wystarczająco specyficzne, aby postawić diagnozę aż do poziomu podgatunku poprzez obserwację nowych biomarkerów .
Metoda identyfikacji MALDI-TOF wymaga czystych kultur, które mają mniej niż 72 godziny. To umieszcza organizm w fazie logarytmicznej z dużą ilością białek rybosomalnych, które są białkami najczęściej wykrywanymi w widmach. Na identyfikacje z tą technologią może również mieć wpływ wystawienie kultury na działanie niskich temperatur, ponieważ zmieniłoby to typową dystrybucję białek.
Systemy identyfikacji drobnoustrojów oparte na profilach biochemicznych
Testy fenotypowe służą do identyfikacji drobnoustrojów na podstawie szlaków metabolicznych i biochemicznych obecnych w tych drobnoustrojach. Dostępnych jest wiele zautomatyzowanych i półautomatycznych systemów komercyjnych. Metody te mogą być bardzo pouczające, ale nie są tak dokładne jak MALDI-TOF lub metody genotypowe.
6,5% bulionu solnego
Test bulionu solnego 6,5% służy do analizy poziomu tolerancji różnych bakterii w warunkach halofilnych. Ten test jest stosowany, ponieważ większość organizmów nie może przetrwać w wysokich stężeniach soli, podczas gdy gronkowce , enterokoki i aerokoki tolerują 6,5% stężenia NaCl.
Wykorzystanie octanu
Test wykorzystania octanu jest używany przede wszystkim do odróżnienia Escherichia coli od przedstawicieli rodzaju Shigella . Wiele Escherichia coli ma zdolność wykorzystywania octanu jako jedynego źródła węgla i energii, podczas gdy Shigella tego nie robi. Ponieważ utylizacja octanu powoduje wzrost pH, dodaje się wskaźnik, który zmienia kolor w warunkach utylizacji octanu.
ALA
ALA ( kwas delta-aminolewulinowy ) służy do badania obecności porfiryny i związków cytochromu . Odkrycie syntezy heminy wskazuje, że organizm to prawdopodobnie Haemophilus .
aminopeptydaza
Test aminopeptydazy analizuje bakterie pod kątem produkcji enzymu aminopeptydazy L-alaniny, enzymu występującego w wielu bakteriach Gram-ujemnych . Dodanie chlorowodorku L-alaniny-4-nitroanilidu do hodowli bakteryjnej działa jak wskaźnik, zmieniając kolor na żółty w obecności aminopeptydazy L-alaniny.
Indeks profilu analitycznego
Wskaźnik profilu analitycznego to system szybkiej identyfikacji oparty na biochemicznych testach inkubacyjnych. Zwykle ten test służy do szybkiego diagnozowania bakterii istotnych klinicznie, umożliwiając lekarzom przeprowadzenie około 20 testów jednocześnie. 
Krążki antybiotykowe
Krążki antybiotykowe służą do testowania zdolności antybiotyku do hamowania wzrostu mikroorganizmu. Ta metoda, która jest powszechnie stosowana w przypadku agaru Muellera-Hintona , polega na równomiernym wysianiu bakterii na płytce Petriego i nałożeniu krążka potraktowanego antybiotykiem na wierzch agaru. Obserwując pierścień utworzony wokół krążka utworzonego z powodu braku wzrostu bakterii, strefę zahamowania , która służy do określenia wrażliwości organizmu na antybiotyk.
Agar z żółcią i eskuliną
Test eskuliny żółciowej służy do różnicowania członków rodzaju Enterococcus od Streptococcus . [ potrzebne źródło ]
Rozpuszczalność żółci
Rozpuszczalność w żółci jest używana do testowania Streptococcus Pneumoniae ze względu na ich wyjątkową zdolność do lizy przez dezoksycholan sodu . Liza wskazuje na S. Pneumoniae, podczas gdy brak lizy nie.
OBÓZ
Test CAMP służy do odróżnienia Streptococcus agalactiae od innych gatunków beta-hemolitycznych Streptococcus. Ten test biochemiczny wykorzystuje fakt, że Streptococcus agalactiae wydziela substancję CAMP, czyniąc ją nieco bardziej hemolityczną, co można zaobserwować na podłożu agarowym z krwią.
katalaza
Test katalazy sprawdza, czy drobnoustrój wytwarza enzym katalazę, który katalizuje rozkład nadtlenku wodoru. Rozsmarowanie próbki kolonii na szkiełku podstawowym i dodanie roztworu nadtlenku wodoru (3% H 2 O 2 ) wskaże, czy enzym jest obecny, czy nie. Bulgotanie jest pozytywnym testem, podczas gdy nic się nie dzieje jest wynikiem negatywnym.
Agar cetrymidowy
Cetrimid Agar Slants to selektywny agar stosowany do izolacji Pseudomonas aeruginosa .
testy CLO
Test CLO służy do diagnozowania H. Pylori w biopsjach pacjentów. Próbkę biopsji umieszcza się w podłożu zawierającym mocznik , który H. Pylori może wykorzystać w niektórych swoich szlakach biochemicznych. Spożycie mocznika wskazuje na pozytywny wynik testu.
koagulaza
Test koagulazy określa, czy organizm może wytwarzać enzym koagulazę, który powoduje krzepnięcie fibryny . Zaszczepienie probówki z osoczem drobnoustrojem wskazuje, czy wytwarzana jest koagulaza. Skrzep wskazuje na obecność koagulazy, podczas gdy brak skrzepu wskazuje na brak koagulazy.
Hydroliza DNA
Agar z DNazą służy do testowania, czy drobnoustroje mogą wytwarzać egzoenzym dezoksyrybonukleazę ( DNazę), która hydrolizuje DNA. Zieleń metylowa jest używana jako wskaźnik w pożywce wzrostowej, ponieważ jest to kation, który zapewnia nieprzezroczystość pożywce z obecnością ujemnie naładowanych nici DNA. Po rozcięciu DNA pożywka staje się klarowna, co wskazuje na obecność aktywności DNazy. Hydrolizę DNA bada się przez hodowanie organizmu na płytce z agarem testowym DNazy (dostarczającej składniki odżywcze i DNA), a następnie sprawdzanie płytki pod kątem hydrolizy. Płytka agarowa zawiera kompleks DNA-zieleń metylowa, a jeśli organizm na agarze hydrolizuje DNA, wówczas zielony kolor blednie, a kolonia jest otoczona bezbarwną strefą.
żelatyna
Test żelatynowy służy do analizy, czy drobnoustrój może hydrolizować żelatynę za pomocą enzymu żelatynazy . Żelatyna sprawia, że agar staje się stały, więc jeśli organizm może wytwarzać żelatynazę i zużywać żelatynę jako źródło energii i węgla, agar stanie się płynny podczas wzrostu.
Gonoczek II
Test Gonochek II, komercyjny test biochemiczny, służy do różnicowania Neisseria lactamica , Neisseria meningitidis , N. gonorrhoeae i Moraxella catarrhalis. Zasadą tego testu jest użycie enzymów natywnych dla organizmu w celu stworzenia barwnego produktu w obecności obcych cząsteczek. Substancja chemiczna [[5-bromo-4-chloro-3-indolilo-beta-D-galaktozyd jest używana w teście, ponieważ N. lactamica może ją hydrolizować z wytworzeniem β- galaktozydazy , zmieniając kolor roztworu na niebieski. Do roztworu dodaje się gamma-glutamylo-p-nitroanilid, aby wskazać, czy bakteria to N. meningitides, która hydrolizuje cząsteczkę z enzymem gamma-glutamyloaminopeptydazą, dając żółty produkt końcowy. Prolilo-4-metoksynaftyloamid znajduje się w roztworze do identyfikacji N. gonorrhoeae ze względu na jego zdolność do hydrolizy cząsteczki za pomocą enzymu hydroksyproliloaminopeptydazy, tworząc czerwono-różową pochodną. M. catarrhalis nie zawiera żadnego z tych enzymów, co powoduje, że roztwór jest bezbarwny. Ten proces identyfikacji trwa łącznie około 30 minut.
Hipopurat
Test diagnostyczny Hippurate służy do różnicowania Gardnerella vaginalis , Campylobacter jejuni , Listeria monocytogenes i paciorkowców grupy B za pomocą chemicznego Hippuratu. Szlak hydrolizy hipuranu, zdolny przez organizmy z niezbędnymi enzymami, wytwarza glicynę jako produkt uboczny. Użycie wskaźnika ninhydryny , który zmienia kolor w obecności glicyny, spowoduje wyświetlenie albo produktu bezbarwnego, wynik negatywny, albo koloru ciemnoniebieskiego, wynik pozytywny.
Krążek maślanu indolu
Krążek maślanu indolu służy do różnicowania między Neisseria gonorrhoeae (wynik ujemny) a Moraxella catarrhalis (wynik dodatni). Ten test obejmuje maślanu , który po posmarowaniu kulturą zmieni kolor, dając wynik pozytywny po 5 minutach inkubacji. Niebieski kolor jest wynikiem pozytywnego testu.
Skośny agar lizynowo-żelazowy
Test skośny na agarze lizyno-żelazowym służy do określenia, czy organizm może dekarboksylować lizynę i/lub wytwarzać siarkowodór .
Lizostafina
Test lizostafinowy służy do różnicowania bakterii Staphylococcus i Micrococcus . Lizostafina może powodować lizę Staphylococcus, ale bakterie Micrococcus są odporne na tę substancję chemiczną.
Test czerwieni metylowej
Test czerwieni metylowej służy do analizy, czy bakteria wytwarza kwasy w wyniku fermentacji cukru. [ potrzebne źródło ]
mikrodaza
Mikrodaza to zmodyfikowany test oksydazy stosowany do różnicowania Micrococcus od Staphylococcus poprzez badanie na obecność cytochromu c . Wynik dodatni powoduje ciemne zabarwienie wokół modyfikatora, podczas gdy wynik ujemny nie powoduje zmiany koloru.
Test azotynów
Test na azotyny jest powszechnie stosowany do diagnozowania infekcji dróg moczowych poprzez pomiar stężenia azotynów w roztworze, co wskazuje na obecność drobnoustrojów Gram-ujemnych. Prosty test na obecność azotynów można przeprowadzić, dodając do próbki 4 M kwasu siarkowego do odczynu kwaśnego, a następnie dodając do roztworu 0,1 M siarczanu żelaza (II). Pozytywny wynik testu na obecność azotynów jest wskazywany przez ciemnobrązowy roztwór powstały z kompleksu jonów żelaza z tlenkiem azotu. [ potrzebne źródło ]
oksydaza
Test oksydazowy wskazuje, czy drobnoustrój jest tlenowy. Używając substancji chemicznej N,N,N,N-tetrametylo-1,4-fenylenodiaminy , akceptora elektronów, który zmienia kolor po utlenieniu przez oksydazę cytochromu c , można wywnioskować, czy drobnoustrój może oddychać tlenowo. Zmiana koloru na fioletowy wskazuje na oddychanie oksydacyjne, podczas gdy brak zmiany koloru świadczy o tym, że organizm nie ma oksydazy cytochromu c.
Deaminaza fenyloalaninowa
Test deaminazy fenyloalaniny służy do stwierdzenia, czy organizm może wytwarzać enzym deaminazę. Deaminaza jest enzymem, który może deaminować aminokwas fenyloalaninę do produktów amoniaku i kwasu fenylopirogronianowego . Test przeprowadza się dodając fenyloalaninę do pożywki wzrostowej i umożliwiając wzrost. Po inkubacji do roztworu dodaje się 10% chlorku żelazowego , który będzie reagował z kwasem fenylopirogronianowym w roztworze, tworząc ciemnozielony kolor, dając pozytywny wynik testu.
PYR
Test PYR służy do sprawdzenia, czy organizm posiada enzymy hydrolizujące L -pirolidonyl-β-naftyloamid. Wynik pozytywny wskazuje, że organizm jest paciorkowcem grupy A i/lub paciorkowcem grupy D.
Odwróć OBÓZ
Odwrotny test CAMP wykorzystuje synergiczne właściwości hemolityczne czynnika CAMP wytwarzanego przez Streptococcus agalactiae z toksyną α wytwarzaną przez Clostridium perfringens . Naniesienie tych dwóch organizmów prostopadle do siebie na płytkę z agarem z krwią spowoduje oczyszczenie agaru z krwią w formie „muszki” dzięki właściwościom hemolitycznym toksyn obu organizmów. Inkubacja wymaga 24 godzin w temperaturze 37 °C.
Agar cytrynianowy Simmonsa
Agar cytrynianowy Simmonsa służy do sprawdzenia, czy organizm może wykorzystywać cytrynian jako jedyne źródło węgla. [ potrzebne źródło ]
Indol punktowy
Punktowy test indolowy służy do określenia, czy drobnoustrój może dezaminować tryptofan w celu wytworzenia indolu . Ten test przeprowadza się przez nasycenie kawałka bibuły filtracyjnej odczynnikiem Indole Kovacs i zeskrobanie porcji drobnoustroju na bibułę. Kolor do różowo-czerwonego wskazuje na wynik pozytywny, natomiast brak zmiany koloru wskazuje na brak tryptofanazy .
Siarkowo-indolowe medium motoryczne
Siarczkowo -indolowe podłoże ruchowe jest trzyczęściowym testem zdolności organizmu do redukcji siarczanów, wytwarzania indoli i zdolności ruchowych. [ potrzebne źródło ]
pochylenie TSI
Test trójcukrowego żelaza (TSI) jest podłożem różnicującym używanym do określenia, czy organizm może fermentować glukozę, sacharozę i/lub laktozę oraz czy organizm może wytwarzać gazowy siarkowodór.
Agar mocznikowy skośny
Skos agarowy z ureazą służy do pomiaru zdolności organizmu do wytwarzania ureazy , enzymu zdolnego do trawienia mocznika w dwutlenku węgla i amoniaku poprzez hydrolizę. Ponieważ amoniak jest alkaliczny, podłoże zawiera czerwień fenolową, wskaźnik, który zmienia kolor z pomarańczowego na różowy, gdy pH wzrasta powyżej 8,1. Gdy stężenie amoniaku zostanie zwiększone do wystarczająco wysokich stężeń, pożywka zmieni kolor na różowy, co wskazuje na obecność produkcji ureazy.
Test Vogesa-Proskauera
Vogesa -Proskauera wykrywa, czy bakteria wytwarza acetoinę w wyniku trawienia glukozy.
Identyfikacja na podstawie komórkowych kwasów tłuszczowych
Analiza kwasu mykolowego
kwasu mikolowego była rozwijającą się dziedziną badań w chromatografii gazowo-cieczowej , ponieważ oferuje rozwiązanie spowalniające tempo wzrostu Mycobacterium . Kwas mikolowy jest kwasem tłuszczowym występującym w chorobie gruźlicy , stanowiącej cel chemiczny dla diagnostów.
Techniki ekstrakcji kwasów nukleinowych
Chlorek cezu / bromek etydyny, wirowanie w gradiencie gęstości
W przypadku ultrawirowania z dużą prędkością przy wyporności , tworzy się gradient gęstości z chlorkiem cezu w wodzie. DNA osiągnie gęstość, która odzwierciedla jego własną gęstość, a bromek etydyny , aby poprawić efekty wizualne, jakie zapewnia prążek kwasu nukleinowego.
Metoda kulek magnetycznych
Opracowano nowe techniki ekstrakcji przy użyciu kulek magnetycznych do oczyszczania kwasów nukleinowych, wykorzystując naładowaną i polimeryczną naturę długich nici DNA. Perełki są niepowlekane, aby zwiększyć powierzchnię i wydajność, podczas gdy inne są bardziej selektywne, ponieważ są pokryte grupami funkcyjnymi, które oddziałują z polimerami obecnymi w drobnoustrojach. Jedną z powszechnych metod jest użycie glikolu polietylenowego do kierowania wiązaniem DNA do kulek magnetycznych. Masa cząsteczkowa i stężenie PEG będą kontrolować, jaką masę cząsteczkową wiąże DNA.
Ekstrakcja fenolowo-chloroformowa
Ekstrakcja fenolowo-chloroformowa to metoda ciecz-ciecz stosowana przez biochemików do oddzielania kwasów nukleinowych od białek i lipidów po lizie komórek. [ potrzebne źródło ] Ta metoda wypadła z łask naukowców i mikrobiologów, ponieważ dostępne są łatwiejsze metody, które wymagają mniej niebezpiecznych chemikaliów.
Ekstrakcja do fazy stałej
Ekstrakcja do fazy stałej , która oddziela długie polimery, takie jak DNA, od innych substancji znajdujących się w komórkach. Jest to podobne do kulek magnetycznych, w których faza stała jest utrwalona i selektywnie wiąże składnik komórkowy, umożliwiając jego izolację.
Metody z wyjściami elektroforetycznymi
Elektroforeza żelowa to technika rozdzielania makrocząsteczek poprzez wykorzystanie ładunku wielu cząsteczek znajdujących się w kwasach nukleinowych i białkach. Jest to również kluczowa metoda sekwencjonowania Sangera. Fragmenty DNA znakowane fluorescencyjnie przechodzą przez polimer i są rozdzielane z dokładnością do jednej zasady. Laser wzbudza znacznik fluorescencyjny i jest rejestrowany przez kamerę. Rezultatem jest elektroforogram, który odczytuje sekwencję DNA.
Na bazie enzymów restrykcyjnych
Mapowanie optyczne
Mapowanie optyczne to technika wykorzystująca wiele enzymów restrykcyjnych do stworzenia genomowego „kodu kreskowego”, do którego można się odwołać w celu zdiagnozowania nieznanego drobnoustroju.
Elektroforeza żelowa w polu pulsacyjnym
Elektroforeza żelowa w polu pulsacyjnym jest techniką stosowaną do rozdzielania dużego DNA w polu elektrycznym, które okresowo zmienia kierunek. Poprzez cięcie segmentów DNA za pomocą enzymów restrykcyjnych można zastosować pole pulsacyjne do oddzielenia segmentów DNA.
Enzymy restrykcyjne, następnie elektroforeza żelowa
Enzymy restrykcyjne są najpierw używane do rozpoznawania, a następnie cięcia określonych sekwencji kwasu nukleinowego. Te pocięte fragmenty DNA można poddać elektroforezie żelowej, aby umożliwić diagnostykę organizmu poprzez odniesienie się do poprzednich wyników elektroforezy żelowej.
Rybotypowanie
Rybotypowanie to szybka, zautomatyzowana metoda diagnostyki mikrobiologicznej polegająca na badaniu rRNA w bakteriach przy użyciu trawienia enzymami restrykcyjnymi i technologii Southern blot.
Oparte na PCR
Analiza wielu loci VNTR
Analiza wielu locus VNTR jest testem służącym do wykrywania powtórzeń tandemowych o zmiennej liczbie , które w diagnostyce mikrobiologicznej pełnią rolę odcisku palca DNA .
Metody oparte na sekwencji DNA
Typowanie sekwencji wielu locus
Typowanie sekwencji multilocus (MLST) to sekwencjonowanie wielu loci w celu zdiagnozowania organizmu poprzez porównanie sekwencji DNA z bazą danych znanych organizmów. Ta metoda jest często stosowana do porównywania izolatów lub szczepów tego samego gatunku w celu sprawdzenia, czy są one nie do odróżnienia lub różnią się od siebie. Jest to powszechne w przypadku śledzenia chorób przenoszonych przez żywność i epidemii zdrowia publicznego. Większość testów MLST jest publikowanych w czasopismach naukowych, więc spójne metody są stosowane na całym świecie. Dostępne są również publiczne bazy danych do śledzenia i porównywania.
Typowanie sekwencji w jednym miejscu
Typowanie sekwencji pojedynczego locus (SLST) to sekwencjonowanie pojedynczego locus organizmu w celu uzyskania danych, które można wykorzystać do porównań na poziomie szczepu między izolatami tego samego gatunku.
Identyfikacje genotypowe
W celu identyfikacji bakterii mikrobiolodzy sekwencjonują gen 16S rRNA, a w celu identyfikacji grzybów sekwencjonują regiony ITS. Oba regiony są częścią operonu rybosomalnego, więc są dobrze zachowane, ale zapewniają wystarczającą zmienność, aby umożliwić specjację. Dokładna identyfikacja wymaga wysokiej jakości danych sekwencyjnych, solidnej analizy danych i obszernej bazy danych mikrobiologicznych znanych organizmów. Do identyfikacji przydatne jest również użycie drzewa łączenia sąsiadów lub innego podejścia filogenetycznego.
Sekwencjonowanie całego genomu (WGS)
Sekwencjonowanie całego genomu i aplikacje genomiczne mogą być wykorzystywane do dopasowywania na dużą skalę i analizy porównawczej zarówno z bakteriami, jak i grzybami. WGS można używać do diagnozowania, identyfikacji lub charakteryzowania organizmu aż do poszczególnych par zasad poprzez sekwencjonowanie całego genomu. WGS może być również używany do porównywania genomów lub średniej tożsamości nukleotydów (ANI) wspólnych genów między dwoma szczepami i może być solidnym sposobem porównywania pokrewieństwa genetycznego, a jeśli jest często używany do badania organizmów zaangażowanych w choroby przenoszone przez żywność i inne ogniska.