Bottromycyna
|
|
| Nazwy | |
|---|---|
| Inne nazwy Bottromycyna A(2); Ester metylowy kwasu Bottromycic A2
|
|
| Identyfikatory | |
|
Model 3D ( JSmol )
|
|
| ChemSpider | |
|
Identyfikator klienta PubChem
|
|
|
|
|
|
| Nieruchomości | |
| C 42 H 62 N 8 O 7 S | |
| Masa cząsteczkowa | 823,05608 g.mol -1 |
|
O ile nie zaznaczono inaczej, dane podano dla materiałów w stanie normalnym (przy 25°C [77°F], 100 kPa).
|
|
Bottromycyna jest makrocyklicznym peptydem o działaniu antybiotycznym . Po raz pierwszy została odkryta w 1957 roku jako naturalny produkt wyizolowany ze Streptomyces bottropensis . Wykazano , że hamuje oporne na metycylinę Staphylococcus aureus ( MRSA ) i enterokoki oporne na wankomycynę ( VRE ) wśród innych bakterii Gram- dodatnich i mykoplazmy . Bottromycyna różni się strukturalnie zarówno od wankomycyny , antybiotyku glikopeptydowego , jak i metycyliny , antybiotyku beta- laktamowego .
Bottromycyna wiąże się z miejscem A rybosomu i blokuje wiązanie aminoacylo- t -RNA , hamując w ten sposób syntezę białek bakteryjnych. Chociaż bottromycyna wykazuje działanie przeciwbakteryjne in vitro , nie została jeszcze opracowana jako antybiotyk kliniczny, potencjalnie ze względu na jej słabą stabilność w osoczu krwi. Aby zwiększyć jego stabilność in vivo , zbadano niektóre pochodne bottromycyny.
Struktura bottromycyny zawiera makrocykliczną amidynę oraz pierścień tiazolowy . Stereochemię absolutną w kilku centrach chiralnych określono od 2009 r. W 2012 r. Opublikowano trójwymiarową strukturę roztworu bottromycyny. Struktura roztworu ujawniła, że kilka grup metylowych znajduje się po tej samej stronie struktury.
Bottromycyna należy do klasy peptydów syntetyzowanych rybosomalnie i modyfikowanych posttranslacyjnie .
Historia
Bottromycyna została po raz pierwszy wyizolowana ze Streptomyces bottropensis w 1957 roku. Od tego czasu została zidentyfikowana u co najmniej dwóch innych przedstawicieli rodzaju Streptomyces ; członkowie Streptomyces są znani jako płodni producenci metabolitów wtórnych. Bottromycyna ma unikalną strukturę, składającą się z makrocyklicznego wiązania amidynowego i czterech β-metylowanych aminokwasów. Bottromycyna blokuje wiązanie aminoacylo- t- RNA z rybosomem poprzez wiązanie się z miejscem A podjednostki 50s. Chociaż bottromycynę odkryto ponad 50 lat temu, brakowało badań po wstępnych badaniach nad bottromycyną aż do ostatnich lat. Brak badań jest potencjalnie wynikiem niskiej stabilności bottromycyny w osoczu krwi. Jednak unikalna struktura i sposób działania sprawiły, że ostatnio bottromycyna stała się bardziej celem opracowywania leków, zwłaszcza biorąc pod uwagę wzrost oporności na antybiotyki. [ potrzebne źródło ]
Mechanizm akcji
Mechanizm działania bottromycyny został potwierdzony prawie 20 lat po jej odkryciu. Bottromycyna działa jako antybiotyk poprzez hamowanie syntezy białek. Blokuje wiązanie aminoacylo- t -RNA z rybosomem poprzez wiązanie się z miejscem A podjednostki 50s. Powoduje to uwolnienie aminoacylo- t -RNA z rybosomu i przedwczesne zakończenie syntezy białek. Porównanie innych antybiotyków, o których wiadomo, że wiążą się z miejscem A rybosomu, w tym mikrokocyny, tetracykliny , streptomycyny i chloramfenikolu , sugeruje, że tylko bottromycyna i chloramfenikol powodują uwalnianie aminoacylo- t- RNA z rybosomu. Spośród tych antybiotyków tylko mikrokokcyna jest również peptydem makrocyklicznym. [ potrzebne źródło ]
Określenie struktury
Bottromycyna jest wytwarzana naturalnie jako seria produktów różniących się schematami metylacji. Wszystkie produkty zawierają metylację waliny i fenyloalaniny. Bottromycyna A2 jest pojedynczo metylowana na prolinie, bottromycyna B nie jest metylowana na prolinie, a bottromycyna C zawiera prolinę podwójnie metylowa. [ potrzebne źródło ]
Częściowa struktura bottromycyny została opisana wkrótce po pierwszym odkryciu bottromycyny. Pierwsze badania strukturalne opierały się na tradycyjnych metodach analizy. Jego peptydu , w tym obecność glicyny i waliny, została po raz pierwszy zasugerowana między innymi przez połączenie hydrolizy kwasowej , acetylacji , barwienia ninhydryną i chromatografii bibułowej . Obecność pierścienia tiazolowego wraz z przylegającą β-metylowaną fenyloalaniną ustalono przez barwienie ninhydryną, utlenianie nadmanganianu potasu i porównanie z syntetycznymi standardami. Podstawnik w postaci estru metylowego odnotowano w 1958 r. To samo badanie wykazało również, że produkt hydrolizy Kunza pozbawiony estru metylowego był biologicznie nieaktywny. Nakamura i współpracownicy donieśli później, że bottromycyna zawierała tert-leucynę i cis -3-metyloprolinę. Zaproponowali również liniową strukturę iminoheksapeptydu.
Te wczesne badania strukturalne były kontynuowane dopiero w ostatnich latach wraz z ponownym zainteresowaniem bottromycyną. W latach 80. i 90. XX wieku potwierdzono, że struktura jest cyklicznym iminopeptydem na podstawie badań NMR, z liniowym łańcuchem bocznym połączonym z makrocyklem poprzez wiązanie amidynowe.
Jednak jego absolutna stereochemia została scharakteryzowana dopiero w 2009 roku. Zaproponowano stereochemię na atomach węgla 18 i 25, porównując przewidywane konformery uzyskane za pomocą dynamiki molekularnej z ograniczeniami eksperymentalnymi uzyskanymi za pomocą eksperymentów NMR. Stereochemię przy węglu 43 potwierdzono przez porównanie 1H NMR autentycznego produktu hydrolizy z chemicznie zsyntetyzowaną próbką tego samego fragmentu. Wreszcie, eksperymenty rotacji optycznej, 1H NMR i HRMS chemicznie syntetyzowanej bottromycyny pasowały do biologicznie produkowanej bottromycyny. [ potrzebne źródło ]
Trójwymiarową strukturę roztworu bottromycyny A2 rozwiązano za pomocą NMR w 2012 r. Ogólną strukturę uzyskano z dobrą rozdzielczością (RMSD 0,74 ± 0,59 Å), z RMSD 0,09 ± 0,06 Å dla makrocyklu. W tym badaniu zaproponowano, że metylowana reszta proliny przyczyniła się do ograniczonej konformacji makrocyklu. Stwierdzono, że reszty metylowanej proliny i β-OMe alaniny znajdują się po tej samej stronie bottroymycyny A2 i zasugerowano, że ta cecha przyczyniła się do wiązania bottromycyny z miejscem A rybosomu.
Biosynteza
Badano wytwarzanie bottromycyny przez S. bottropensis i S. scabies , jak również wytwarzanie analogu bottromycyny określanego jako bottromycyna D. W 2012 roku zostało niezależnie potwierdzone przez wiele grup, że bottromycyna jest wytwarzana jako naturalny produkt peptydu rybosomalnego, który następnie jest modyfikowany potranslacyjnie. Wcześniej nie było jasne, czy bottromycyna jest wytwarzana przez nierybosomalną maszynerię syntetazy peptydowej (NRPS). Obecność aminokwasów innych niż 20 aminokwasów proteogennych jest często cechą produktów NRPS, ponieważ mechanizm NRPS może bezpośrednio włączać inne aminokwasy, między innymi chemiczne elementy budulcowe. Synteza peptydów rybosomalnych, która jest tą samą maszynerią, która wytwarza wszystkie białka znajdujące się w komórce, jest ograniczona do 20 aminokwasów proteogennych. Jednak stwierdzono, że bottromycyna jest wysoce zmodyfikowanym peptydem rybosomalnym dzięki połączeniu badań eksploracji genomu i delecji genów.
W syntezie peptydów rybosomalnych produkt końcowy wynika z modyfikacji wyjściowego materiału liniowego peptydu, który ulega translacji przez rybosom z transkryptu mRNA. U S. scabies peptyd prekursorowy, określany jako BtmD, jest peptydem złożonym z 44 aminokwasów. Peptyd prekursorowy jest określany jako BmbC w S. bottropensis . Aminokwasy tworzące rdzeń bottromycyny to reszty 2-9 w BtmD: Gly-Pro-Val-Val-Val-Phe-Asp-Cys. W bottromycynie D sekwencja to Gly-Pro-Ala-Val-Val-Phe-Asp-Cys, a peptyd prekursorowy jest określany jako BstA. BstA wykazuje wysoką homologię sekwencji z BtmD w regionie peptydu naśladowczego. W przeciwieństwie do innych naturalnych produktów peptydów rybosomalnych, które są normalnie syntetyzowane z peptydem liderowym, który jest rozszczepiany, bottromycyna jest syntetyzowana z peptydem naśladowczym. Obecność peptydu naśladowczego zidentyfikowano za pomocą analizy bioinformatycznej klastra biosyntezy bottromycyny.
Zidentyfikowano kompletny klaster genów biosyntetycznych dla bottromycyny. Przewiduje się, że zawiera 13 genów, w tym peptyd prekursorowy (notacja będzie następowała po Crone i współpracownikach; inne badania dały podobne wyniki). , że jeden z genów w klastrze, btmL , jest regulatorem transkrypcji . Proponuje się , aby inny gen, btmA , eksportował bottromycynę. Oczekuje się, że pozostałe dziesięć genów zmodyfikuje peptyd prekursorowy btmD z peptydu liniowego do końcowego produktu makrocyklicznego.
| S. świerzb | S. bottropensis | WMMB272 | Przewidywana funkcja |
|---|---|---|---|
| btmA | bmbT | bstK | Nadrodzina/transporter głównego moderatora |
| btmB | bmbA | bstB | o -Metylotransferaza |
| btmC | bmbB | bstC | Radykalna metylotransferaza SAM |
| btmD | bmbC | bstA | Peptyd prekursorowy |
| btmE | bmbD | bstD | Domena YcaO |
| btmF | bmbE | bstE | Domena YcaO |
| btmG | bmbF | bstF | Radykalna metylotransferaza SAM |
| btmH | bmbG | bstG | Hydrolaza α/β |
| btmI | bmbH | bstH | Hydrolaza metalo-zależna |
| btmJ | bmb I | bstI | Cytochrom P450 |
| btmK | bmbJ | bstJ | Radykalna metylotransferaza SAM |
| btmL | bmbR | Regulator transkrypcji | |
| btmM | bmbK | aminopeptydaza M17 |
Postawiono hipotezę szlaku biosyntezy na podstawie proponowanych funkcji genów (patrz rysunek ) . Przewiduje się, że btmM , wykazujący homologię do aminopeptydaz Zn+2, rozszczepia N-końcową resztę metioniny, która nie występuje w końcowym produkcie bottromycyny. btmE i btmF oba zawierają domeny podobne do YcaO . Uważa się, że jeden Chociaż nie jest jasne, który enzym jest odpowiedzialny za który etap, przypuszcza się, że jeden katalizuje tworzenie makrocyklicznej amidyny, podczas gdy drugi katalizuje tworzenie tiazoliny. btmJ , kodujący enzym o homologii z cytochromem P450, może utleniać tiazolinę do tiazolu. btmH lub btmI oba wykazują homologię z enzymami hydrolitycznymi (odpowiednio hydrolaza α/β i hydrolaza metalo-zależna) mogą katalizować hydrolizę peptydu naśladowczego. Alternatywną proponowaną rolą btmH lub btmI jest działanie jako cyklodehydrataza w makrocyklizacji. Badania delecji genów nie wyjaśniły funkcji innych białek w klastrze.
Metylotransferazy w klastrze biosyntetycznym
Analiza bioinformatyczna zidentyfikowała cztery metylotransferazy w klastrze. Bioinformatyka sugeruje, że btmB jest O -metylotransferazą , podczas gdy pozostałe trzy, btmC , G i K , to rodnikowe metylotransferazy S -adenozylometioniny (SAM) . Uważa się, że radykalne metylotransferazy SAM β-metylują reszty aminokwasowe w peptydzie prekursorowym. Uważa się, że btmC metyluje fenyloalaninę, uważa się, że btmG metyluje obie waliny, a uważa się, że btmK metyluje prolinę na podstawie badań delecji genów.
Trzy domniemane radykalne metylotransferazy SAM zakodowane w szlaku są interesujące zarówno ze względów mechanistycznych, jak i biosyntetycznych. Radykalne metylotransferazy SAM prawdopodobnie metylują substraty za pomocą niezwykłego mechanizmu. Biosyntetycznie, β-metylacje aminokwasów są bardzo niezwykłe w produktach naturalnych. Politeonamid B, naturalny produkt peptydowy wytwarzany przez symbiont morski, jest jedynym innym strukturalnie scharakteryzowanym przykładem bezpośredniej β-metylacji naturalnego produktu peptydowego. Proponowany transfer metylu z enzymu wykorzystującego SAM był poparty wcześniejszymi badaniami żywieniowymi ze znakowaną metioniną; znakowana metionina jest używana, ponieważ metionina jest przekształcana w SAM w komórkach. Co więcej, w tym badaniu wykorzystano stereospecyficznie znakowaną metioninę ([metylo-( 2H - 3H )]-(2S , metylo- R )-metioninę), aby wykazać, że metylacja zachodziła z retencją netto stereochemii na grupie metylowej. Autor spekulował, że retencja netto wskazuje na radykalny mechanizm z produktem pośrednim B12. Transfer rodnikowy z kobalaminy B12 i SAM wykazano z kilkoma scharakteryzowanymi rodnikowymi metylotransferazami SAM. Chociaż dowody wskazują na radykalną β-metylację podczas biosyntezy bottromycyny, dopiero okaże się, czy hipotezy bioinformatyczne i badania żywieniowe zostaną poparte testami in vitro .
Podstawienie Val3Ala w bottromycynie D nie zmienia wzoru β-metylacji między bottromycyną A2 i D, ponieważ Val3 jest jedyną waliną niemetylowaną w bottromycynie A2. W związku z tym nadal istnieją trzy przewidywane enzymy zależne od radykalnych SAM w biosyntetycznym klastrze bottromycyny D: bstC , bstF i bstJ .
Od 2013 r. wszystkie opublikowane badania biosyntetyczne były bioinformatyczne lub oparte na komórkach. Nie opublikowano jeszcze żadnych testów biochemicznych bezpośrednio wykazujących funkcję białka. Prawdopodobnie in vitro w celu lepszego wyjaśnienia szlaku biosyntezy.
Totalna synteza
Całkowita synteza bottromycyny została zakończona w 2009 roku. Syntezę przeprowadzono w 17 etapach. Chociaż bottromycyna jest produktem naturalnym opartym na peptydach, zawiera niezwykły heterocykl makrocykliczny i tiazolowy, tak że nie można było przeprowadzić całkowitej syntezy przy użyciu tradycyjnej syntezy peptydów w fazie stałej . Syntezę przeprowadzono stosując kombinację sprzęgania peptydów i innych metod. przeprowadzono sekwencję etapów kondensacji, reakcji Mannicha i dekarboksylacji katalizowanej palladem. Ten związek pośredni przygotowano stereoselektywnie. W celu uzyskania wiązania amidynowego, tripeptydowy związek pośredni sprzęgnięto z tioamidem zabezpieczonym ftaloilem poprzez kondensację za pośrednictwem rtęci z użyciem trifluorometanosulfonianu rtęci(II) ( Hg(OTf) 2 ) z wytworzeniem rozgałęzionej amidyny jako związku pośredniego. Aby otrzymać makrocykl produktu końcowego, wymagana była makrolaktamizacja półproduktu zawierającego amidynę. Makrolaktamizację przeprowadzono z 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimidem (EDCI) i iPr2NEt , co dało produkt końcowy, bottromycynę A2. Aby potwierdzić, że zsyntetyzowana bottromycyna A2 ma taką samą stereochemię jak naturalna bottromycyna A2, produkt badano za pomocą rotacji optycznej , 1H i 13C NMR, IR i HRMS. Stwierdzono, że dane pasują do izolowanej bottromycyny A2. Ponadto stwierdzono, że syntetyczna próbka bottromycyny ma działanie przeciwbakteryjne zarówno przeciwko MRSA, jak i VRE, chociaż nie podano danych ilościowych. Pełne renderowanie schematu syntetycznego można zobaczyć pod linkiem zwiniętego schematu syntetycznego.
| Schemat syntezy bottromycyny, jak opisali Shimamura i in. |
|---|
W 2012 roku opisano alternatywną syntezę makrocyklicznego układu pierścieniowego bottromycyny i wiązania amidynowego. Synteza została osiągnięta w 10 krokach. W przeciwieństwie do poprzedniej syntezy, Ackerman i współpracownicy zsyntetyzowali liniowy peptyd i uzyskali wewnątrzcząsteczkowe tworzenie amidyny przy użyciu S -metylowanego endotiopeptydu. Endotiopeptyd otrzymano w reakcji tio-Ugi . Powstały makrocykl otrzymano jako mieszaninę racemiczną przy wiązaniu amidynowym. Pełny schemat syntetyczny można obejrzeć pod linkiem zwiniętego schematu syntetycznego.
| Syntetyczny schemat alternatywnej syntezy makrocyklu bottromycyny opisany przez Ackermanna i in. |
|---|
Pochodne
Po całkowitej syntezie bottromycyny Kobayashi i współpracownicy zsyntetyzowali serię pochodnych bottromycyny i ocenili ich aktywność przeciw MRSA i przeciw VRE. Zbadano tylko pochodne ugrupowania estru metylowego, ponieważ stwierdzono, że ester metylowy był zarówno ważny dla działania przeciwbakteryjnego, jak i niestabilny w osoczu krwi. Zsyntetyzowano serię siedemnastu pochodnych, z pochodnymi należącymi do trzech ogólnych kategorii: pochodne amidowe , pochodne mocznika i pochodne ketonów . Wszystkie analogi z wyjątkiem kwasu karboksylowego i analogów hydrazydowych derywatyzowano z wyizolowanej bottromycyny A2 przy użyciu aktywowanego estru azydkowego. Pochodne przetestowano na sześciu Gram-dodatnich szczepach bakterii: Staphylococcus aureus FDA209P, S. aureus Smith, MRSA HH-1, MRSA 92-1191, Enterococcus faecalis NCTC12201 i E. faecalis NCTC12203 (oba VRE).
Bottromycyna A2 wykazywała niską aktywność mikromolarną wobec wszystkich badanych szczepów, w zakresie od MIC 0,5 μg/ml w E. faecalis NCTC12203 do 2 μg/ml w MRSA HH-1. Stwierdzono, że rodziny amidów i pochodnych mocznika mają słabszą aktywność przeciwbakteryjną niż bottromycyna A2 przeciwko S. aureus , MRSA i VRE. Wartości MIC dla pochodnych amidowych i mocznikowych były na ogół czterokrotnie większe niż wartości dla bottromycyny A2. Były one jednak znacznie bardziej stabilne w osoczu myszy niż bottromycyna A2. Bottromycyna A2 całkowicie rozkładała się w osoczu myszy po 10 minutach i wykazywała 0% aktywność resztkową po ekspozycji na surowicę szczura. Tylko jedna pochodna miała aktywność resztkową poniżej 50%. W przeciwieństwie do tego wiele pochodnych zachowało znaczny procent resztkowej aktywności anty-MRSA po ekspozycji na surowicę. Stwierdzono, że tioestrowe związki pośrednie do pochodnych ketonowych są niestabilne, wykazując aktywność resztkową 0%, chociaż mają lepszą aktywność przeciwbakteryjną, wykazując submikromolarne wartości MIC. Keton propylowy okazał się najbardziej obiecującą pochodną ze wszystkich otrzymanych analogów, wykazując zarówno aktywność przeciwbakteryjną wobec badanych szczepów bakteryjnych, jak i stabilność w osoczu, zachowując 100% aktywność resztkową. Wartości MIC uzyskane dla pochodnej propylowej były takie same jak dla bottromycyny A2, z wyjątkiem przypadku NCTC12201, dla którego MIC wynosiło 2 μg/ml dla pochodnej i MIC 1 μg/ml dla bottromycyny A2. Podsumowanie wartości MIC dla badanych szczepów bakteryjnych przedstawiono poniżej.
Nawet najmniej aktywne pochodne bottromycyny wykazywały większą aktywność przeciw VRE niż wankomycyna, którą zastosowano jako antybiotyk kontrolny w tym badaniu. Pochodna propylowa i bottromycyna A2 miały podobne działanie przeciwbakteryjne do linezolidu , syntetycznego antybiotyku aktywnego przeciwko bakteriom Gram-dodatnim, w tym MRSA i VRE, we wszystkich badanych szczepach bakteryjnych. Podsumowując, wyniki tego badania sugerują, że dalsze modyfikacje bottromycyny mogą prowadzić do bardziej stabilnego, skutecznego antybiotyku.
| Mieszanina | S. aureus FDA209P (μg/ml) | S. aureus Smith (μg/ml) | MRSA HH-1 (μg/ml) | MRSA 92-1191 (μg/ml) | VRE NCTC12201 (μg/ml) | VRE NCTC12203 (μg/ml) | Resztkowa aktywność anty-MRSA (%) |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Bottromycyna A2 | 1 | 1 | 1 | 2 | 1 | 0,5 | 0 |
| Hydrolizowana bottromycyna A2 (kwas karboksylowy) | 64 | 64 | 64 | 128 | 128 | 32 | - |
| Pochodna propylu | 1 | 1 | 1 | 2 | 2 | 0,5 | 100 |
| Wankomycyna | 1 | 1 | 0,5 | 1 | >128 | >128 | - |
| Linezolid | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | - |
Zidentyfikowano również naturalną pochodną bottromycyny, bottromycynę D. Jest wytwarzany w morskim Streptomyces , szczep WMMB272. Chociaż ester metylowy jest nadal obecny w bottromycynie D, jedna z makrocyklicznych walin jest zmutowana do alaniny. Określono minimalne stężenie hamujące (MIC) bottromycyny D i stwierdzono, że jest ona tylko nieznacznie mniej aktywna niż bottromycyna A2 (2 μg/ml dla bottromycyny D w porównaniu z 1 μg/ml dla bottromycyny A2 ) . Autorzy postulowali, że za mniejszą aktywność bottromycyny D może odpowiadać większa elastyczność konformacyjna bottromycyny D.
Od 2013 r. W literaturze nie opisano dalszych badań przeciwbakteryjnych syntetycznych lub biosyntetycznych pochodnych bottromycyny. Poszukiwanie skutecznych analogów będzie możliwe dzięki statusowi bottromycyny jako peptydu rybosomalnego. Analogi można badać biosyntetycznie zmieniając sekwencję peptydu prekursorowego; zmiana sekwencji aminokwasowej doprowadzi bezpośrednio do zmodyfikowanej struktury bottromycyny.
Potencjał kliniczny
Od 2013 roku bottromycyna nie została zatwierdzona do żadnych zastosowań klinicznych ani nie była testowana na ludziach. Stabilność in vivo bottromycyny musi zostać poprawiona, zanim będzie można ją uznać za kandydata na lek. Prace Kobayashiego i współpracowników już rozpoczęły się w celu rozwiązania tego problemu, ale mogą być prowadzone dalsze prace. Konieczność znalezienia nowych antybiotyków do zwalczania oporności na antybiotyki oznacza, że biologiczne i syntetyczne zainteresowanie bottromycyną prawdopodobnie będzie kontynuowane. Połączenie technik biologicznych i syntetycznych może dać zarówno skuteczny, jak i stabilny analog bottromycyny do opracowania jako potencjalnego kandydata na lek.