Dehydrogenaza celobiozowa (akceptor)
| dehydrogenaza celobiozowa (akceptor) | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Identyfikatory | |||||||||
| nr WE | 1.1.99.18 | ||||||||
| nr CAS | 54576-85-1 | ||||||||
| Bazy danych | |||||||||
| IntEnz | Widok IntEnz | ||||||||
| BRENDA | Wpis BRENDY | ||||||||
| ExPASy | Widok NiceZyme | ||||||||
| KEGG | Wpis KEGG | ||||||||
| MetaCyc | szlak metaboliczny | ||||||||
| PRYM | profil | ||||||||
| Struktury PDB | RCSB PDB PDBe PDB suma | ||||||||
| Ontologia genów | AmiGO / QuickGO | ||||||||
| |||||||||
W enzymologii dehydrogenaza celobiozowa (akceptor) ( EC 1.1.99.18 ) jest enzymem , który katalizuje reakcję chemiczną
- celobioza + akceptor cellobiono-1,5-lakton + zredukowany akceptor
Zatem dwoma substratami tego enzymu są celobioza i akceptor , podczas gdy jego dwoma produktami są celobiono-1,5-lakton i zredukowany akceptor .
Enzym ten należy do rodziny oksydoreduktaz , a konkretnie działających na grupę CH-OH donora z innymi akceptorami. Systematyczna nazwa tej klasy enzymów to celobioza: akceptor 1-oksydoreduktazy . Inne powszechnie używane nazwy to dehydrogenaza celobiozowa , oksydoreduktaza celobiozowa , oksydoreduktaza celobiozowa Phanerochaete chrysosporium , CBOR , oksydaza celobiozowa , celobioza: 1-oksydoreduktaza tlenowa , CDH i celobioza: (akceptor) 1-oksydoreduktaza . Czasami wykorzystuje jeden kofaktor , FAD , ale w większości przypadków zarówno hem, jak i FAD zlokalizowane są w oddzielnych domenach. Czyni enzym jedną z bardziej złożonych zewnątrzkomórkowych oksydoreduktaz. Jest wytwarzany przez organizmy rozkładające drewno.
Studia strukturalne
Do tej pory opisano struktury rozdzielonych domen dehydrogenazy (DH) i cytochromu (CYT) ( kody dostępu PDB 1NAA i 1PL3 ). W 2015 roku zidentyfikowano pełnowymiarowe struktury enzymu dla CDH z Crassicarpon hotsonii syn. Myriococcum thermophilum ( Ch CDH, kod dostępu PDB 4QI6 ) i CDH z Neurospora crassa ( Nc CDH, kod dostępu PDB 4QI7 ).
Ruchliwość domeny CYT przez długi czas uniemożliwiała krystalizację i rentgenowskie wyjaśnienie struktury CDH. Jednak struktury krystaliczne poszczególnych domen CYT i DH wykazywały już komplementarność strukturalną i położenie interfejsu domen oraz zapewniały strukturalną podstawę międzydomenowego transferu elektronów obserwowanego w badaniach biochemicznych i bioelektrochemicznych.
Strukturę krystaliczną domeny DH Phanerochaete chrysosporium opisali Hallberg i in. w kształcie orzeszka ziemnego o wymiarach ~72 x 57 x 45 Å. Obserwowany fałd białkowy GMC-oksydoreduktazy zawiera subdomenę wiążącą FAD i subdomenę wiążącą substrat. Subdomena wiążąca FAD składa się głównie z fałdu Rossmanna, który jest typowy dla enzymów zależnych od NAD (P) i FAD, podczas gdy subdomena wiążąca substrat składa się z centralnego skręconego, siedmioniciowego arkusza β z trzema α-helisami na po jednej stronie arkusza i miejsce aktywne po drugiej stronie. Subdomena wiążąca substrat zawiera miejsce aktywne, które składa się z miejsca wiązania substratu (miejsce B) i miejsca katalitycznego (miejsce C). Miejsce B utrzymuje nieredukujący koniec celobiozy na miejscu, podczas gdy w miejscu C utlenia redukujący koniec celobiozy.
Domena CYT składa się z elipsoidalnej antyrównoległej kanapki β o wymiarach 30 x 36 x 47 Å i topologii przypominającej zmienny łańcuch ciężki fragmentu Fab przeciwciała z pięcioniciowym wewnętrznym arkuszem β i sześcioniciowym zewnętrznym β- arkusz . Ten fałd białkowy był nowym fałdem obserwowanym dla cytochromu. Obie pojedyncze struktury krystaliczne dostarczyły mechanistycznych spostrzeżeń. Domena DH została nasączona inhibitorem celobionolaktamem, który rozwiązał pozycję wiązania substratu i dał mechanistyczne wyjaśnienie półreakcji redukcyjnej [52]. Struktura domeny CYT ujawniła niezwykłą osiową koordynację żelaza hem b przez resztę His i Met, która jest podstawą wewnątrzcząsteczkowego transferu elektronów między dwiema domenami. Badanie mutacji ligandów hemu koordynujących żelazo, przeprowadzone przez Rotseart i in. wykazało, że albo zastąpienie Met przez His, albo zamiana obu ligandów skutkowała nieaktywną domeną CYT IET.
W 2015 r. wyjaśnienie pełnej długości struktur CDH z Crassicarpon hotsonii (syn. Myriococcum thermophilum ) (PDB ID: 4QI6) i Neurospora crassa (PDB ID: 4QI7) zwiększyło zrozumienie mobilności domeny dla roli CYT jako wbudowany mediator redoks. Tan i Kracher et al. wykazało, że CDH istnieje w stanie zamkniętym i konformacji w stanie otwartym. W stanie zamkniętym hem b przyjmuje elektron z FAD po utlenieniu substratu i przekazuje elektron zewnętrznemu akceptorowi elektronów w stanie otwartym. Stwierdzono, że IET nie zależy od wystającej reszty Trp znajdującej się bezpośrednio między FAD a kofaktorem hemu, ale od odsłoniętej powierzchni Arg w kanale substratu, co stabilizuje oddziaływanie z CYT poprzez grupę propionianu hemu. Propionian-D hemu b jest zwinięty, a wiązanie wodorowe z Tyr99 w domenie CYT uniemożliwia mu bezpośrednią interakcję z miejscem aktywnym DH. Najbliższa odległość od krawędzi do krawędzi między hemem b a FAD wynosi 9 Å, co mieści się w granicach 14 Å dla wydajnego przenoszenia elektronów. Ruchoma domena CYT CDH jest cechą unikalną wśród oksydoreduktaz GMC i nabytą na późniejszym etapie ewolucji. Ruchliwość domeny CYT jest regulowana przez elastyczny łącznik peptydowy o różnej długości i składzie ( np . N. crassa CDH IIA = 17 aminokwasów, N. crassa CDH IIB = 33 aminokwasy), który łączy obie domeny. Ruch CYT obserwowano w badaniach AFM i SAXS.
Klasyfikacja filogenetyczna
Sekwencje CDH ewoluowały w cztery gałęzie filogenetyczne: Sekwencje CDH klasy I znajdują się wyłącznie w Basidiomycota, podczas gdy sekwencje CDH z klasy II, klasy III i klasy IV występują tylko w Ascomycota. CDH klasy I mają silne powinowactwo do celulozy i prawdopodobnie wiążą się przez miejsce wiązania celulozy na powierzchni domeny DH, które różni się od miejsca aktywnego. To miejsce wiązania celulozy nie występuje w innych klasach CDH. Wiązanie z celulozą w CDH klasy II zależy od obecności C-końcowego modułu wiążącego węglowodany z rodziny 1 (CBM1). Niektóre CDH klasy II mają C-końcową CBM1 i są klasyfikowane jako CDH klasy IIA, podczas gdy CDH klasy IIB nie mają CBM1 i nie wiążą się z celulozą. Inne różnice między CDH klasy I i klasy II dotyczą specyficzności substratowej i optymalnego pH IET. Niewiele można powiedzieć o CDH klasy III i IV, które nie zostały jeszcze wyrażone i scharakteryzowane. Z dopasowań sekwencji można wywnioskować inną geometrię miejsca aktywnego, ale substrat jest nieznany. CDH klasy IV są najbardziej spokrewnione ewolucyjnie z innymi klasami CDH i nie zawierają domeny CYT przenoszącej elektrony, co sugeruje inną rolę fizjologiczną i utratę zdolności do DET.
Kataliza
CDH katalizuje utlenianie 2e-/2H+ anomerycznego atomu węgla (C1) disacharydu celobiozy do cellobiono-δ-laktonu, który następnie hydrolizuje w wodzie do kwasu celobionowego. Oprócz naturalnego substratu, celobiozy i celodekstryn, celotriozy, celotetraozy, celopentaozy i celoheksozy, również budulcowa jednostka celulozy, glukoza, a także monomery budulcowe hemicelulozy lub produkty rozpadu galaktozy, mannozy, mannobiozy, mannopentaozy, ksylozy, ksylobiozy i ksylotriozy, czyli pochodzące ze skrobi maltoza, maltotrioza i maltotetraoza zostały opisane jako substraty o bardzo różnej wydajności katalitycznej dla CDH. Bardzo dobrym substratem niezwiązanym z polisacharydami roślinnymi jest laktoza, ze względu na podobieństwo strukturalne do celobiozy. Celobioza, cellooligosacharydy i laktoza są substratami, dla których CDH wykazuje najwyższą wydajność katalityczną, podczas gdy monosacharydy są złymi substratami o bardzo niskim powinowactwie (wysokie KM) tylko do katalitycznego miejsca C CDH. Skrajna rozbieżność wydajności katalitycznej P. chrysosporium dla celobiozy w stosunku do glukozy (87500 : 1) jest związana z fizjologiczną rolą enzymu podstawczaków białej zgnilizny. W ascomycete CDH rozróżnianie glukozy jest mniej ścisłe i przekształcane jest szersze spektrum mono- i oligosacharydów. Oczywiście powinowactwo CDH do substratów di- i oligosacharydowych jest znacznie większe niż do monosacharydów. Jednak CDH klasy II mają KM dla glukozy 10–100 mM, co mieści się w zakresie oksydazy glukozowej zależnej od FAD, również oksydoreduktazy GMC (5–100 mM). Niższa szybkość katalityczna CDH klasy I i II (poniżej 50 s -1 ) w porównaniu z oksydazą glukozową (300-2000 s -1 ) jest prawdopodobnie ewolucyjną adaptacją do nabytej domeny CYT w celu optymalizacji IET i zapobiegania daremnym reakcjom substratu w bezczynnej witrynie aktywnej.
CDH jako bioelektrokatalizator
CDH wykazuje różne właściwości, które czynią go odpowiednim elektrokatalizatorem do bioczujników lub ogniw biopaliwowych. W przeciwieństwie do innych oksydoreduktaz GMC przekształcających węglowodany, można się z nią kontaktować poprzez pośredniczony transfer elektronów (MET) lub bezpośredni transfer elektronów (DET). Opracowano oparte na CDH biosensory drugiej i trzeciej generacji do ilościowego oznaczania molekuł o znaczeniu komercyjnym lub medycznym, takich jak glukoza czy laktoza. Zaletą bioczujników drugiej generacji jest ich wysoka czułość, zaletą bioczujników trzeciej generacji jest uniknięcie obecności mediatorów redoks we wszczepialnych systemach monitorowania glikemii. Bioczujniki trzeciej generacji oparte na CDH mają solidną wydajność ze względu na dobrą stabilność termiczną i obrotową CDH i ruchomej domeny CYT, które mogą wchodzić w interakcje z wieloma materiałami elektrod i modyfikacjami powierzchni oraz dostarczać dość wysokie gęstości prądu.
Bioczujniki oparte na CDH
CDH jest używany jako element bioczujnika do wykrywania wielu różnych analitów od 1992 roku, kiedy to Elmgren i in. donieśli o nowym bioczujniku wrażliwym na celooligosacharydy o stopniach polimeryzacji od 2 do 6, laktozę i maltozę. Dokonano przeglądu badań nad CDH wykorzystywanych jako bioczujniki od tego czasu do 2013 roku, dostarczając listy bioczujników opartych na CDH zarówno w trybie DET, jak i MET dla fenoli (katecholu, dopaminy, noradrenaliny, hydrochinonu, aminofenolu) i węglowodanów (celobiozy, laktozy, maltozy, glukozy ).
Zarówno CDH klasy I, jak i klasy II zostały wykorzystane jako biokatalizatory w bioczujnikach. Zgodnie z ich preferowanymi substratami, CDH klasy I były stosowane głównie do wykrywania i oznaczania ilościowego fenoli, celobiozy i laktozy, podczas gdy CDH klasy II były stosowane do wykrywania celobiozy, laktozy, maltozy i glukozy. Spośród CDH klasy I, Phanerochaete chrysosporium CDH jest najlepiej zbadanym enzymem, który został wykorzystany do wykrywania różnych pochodnych fenolu, celobiozy i laktozy. Phanerochaete sordida i Trametes villosa CDH zastosowano do wykrywania laktozy, a Sclerotium rolfsii CDH do wykrywania dopaminy.
Spośród CDH klasy II jako element rozpoznawania celobiozy, laktozy, glukozy i maltozy wykorzystano Crassicarpon hotsonii i Crassicarpon thermophilum CDH, a CDH Humicola insolens dla glukozy i maltozy. We wszystkich przypadkach wykrycie maltozy wykazało jedynie, że maltoza nie zakłóca wykrywania glukozy, co jest ważne przy oznaczaniu stężenia glukozy we krwi.
W 2017 roku firma DirectSens GmbH wprowadziła na rynek pierwszy bioczujnik laktozy oparty na CDH do wykrywania bardzo niskich stężeń laktozy w produktach mlecznych o obniżonej zawartości laktozy. LactoSens to jedyny biosensor trzeciej generacji na rynku, dystrybuowany na całym świecie do firm mleczarskich.
