Inwazja (rak)
W przypadku raka inwazja jest bezpośrednim rozszerzeniem i penetracją komórek nowotworowych do sąsiednich tkanek . Zasadniczo różni się od przerzutów , czyli rozprzestrzeniania się komórek nowotworowych przez układ krążenia lub układ limfatyczny do bardziej odległych miejsc. Jednak inwazja naczyń limfatycznych jest na ogół pierwszym etapem przerzutów.
Wstęp
Liczne badania potwierdziły istnienie dwóch głównych wzorców inwazji komórek nowotworowych poprzez migrację komórek : zbiorową migrację komórek i indywidualną migrację komórek, dzięki której komórki nowotworowe pokonują bariery macierzy pozakomórkowej i rozprzestrzeniają się do otaczających tkanek. Każdy wzór migracji komórek wykazuje określone cechy morfologiczne i biochemiczne/molekularne mechanizmy genetyczne leżące u podstaw migracji komórek. W każdym schemacie inwazji komórek nowotworowych obserwuje się dwa rodzaje migrujących komórek nowotworowych, mezenchymalne (podobne do fibroblastów) i ameboidalne. W niniejszym przeglądzie opisano kluczowe różnice między wariantami migracji komórek nowotworowych, rolę przejść nabłonkowo-mezenchymalnych, kolektywnych amebowych, mezenchymalnych ameboidalnych i ameboidalno-mezenchymalnych, a także znaczenie różnych czynników nowotworowych i cząsteczek podścieliska w inwazji nowotworu . Zebrane dane i fakty są niezbędne do zrozumienia, w jaki sposób wzorce inwazji komórek rakowych są powiązane z progresją raka i skutecznością terapii. Dostarczono przekonujących dowodów na to, że morfologiczne objawy wzorców inwazji charakteryzują się różnorodnością struktur tkankowych (guzowych). Przedstawiono wyniki badań własnych, aby pokazać związek raka piersi z wewnątrzguzową heterogenicznością morfologiczną, co najprawdopodobniej odzwierciedla rodzaje migracji komórek nowotworowych i wynika z różnej aktywności cząsteczek adhezyjnych w komórkach nowotworowych o odmiennej budowie morfologicznej.
Inwazyjny wzrost i przerzuty jako przejaw złośliwości raka
Wyniki licznych badań eksperymentalnych i klinicznych nowotworów złośliwych wykazały, że inwazyjny wzrost i przerzuty są głównymi przejawami progresji nowotworu , które reprezentują dwa ściśle ze sobą powiązane procesy.
Nowotwór złośliwy charakteryzuje się możliwością realizacji takiego zjawiska biologicznego jak kaskada przerzutów, która jest unikalnym wieloetapowym „programem”, w którym inwazja komórek jest wyzwalaczem i kluczowym czynnikiem dla dalszej progresji nowotworu i przerzutów w odległych narządach i tkankach. Masywne zmiany przerzutowe prowadzą do rozwoju ciężkiej niewydolności narządowej, aw konsekwencji do śmierci pacjenta. Przedział między punktami „końcowymi” złożonego inwazyjnego procesu przerzutowego – naciekania guza pierwotnego do otaczających tkanek i powstawania ognisk przerzutowych – obejmuje kilka etapów, których przejście jest bezwzględnie konieczne do pomyślnego rozwoju i późniejszej progresji nowotworu wzrost: wynaczynienie, przeżycie i obecność w krążeniu ogólnoustrojowym, wynaczynienie z późniejszą kolonizacją narządów przez komórki nowotworowe i powstawanie klinicznie wykrywalnych przerzutów. Wzrostowi nowotworu towarzyszy rosnący nacisk na struktury macierzy zewnątrzkomórkowej, podczas gdy mikrośrodowisko tkanki walczy o zachowanie swojej funkcjonalno-anatomicznej integralności poprzez rosnący nacisk na komórki nowotworowe. Czynnikami ograniczającymi wzrost nowotworu złośliwego są: błona podstawna i różne składniki otaczającego zrębu, zwiększone ciśnienie śródmiąższowe, ograniczenie dopływu tlenu do komórek nowotworowych i tworzenia aktywnych form tlenu, stany niedotlenienia i stała ekspozycja na komórki układu odpornościowego. Ze względu na heterogeniczność wewnątrzguzową niektóre komórki nowotworowe w walce o przetrwanie mogą ulec regresji i śmierci, podczas gdy inne komórki, które są odporne na silne, przeciwdziałające czynnikom mikrośrodowiska, zyskują agresywny fenotyp i zdolność do progresji przerzutowej. Inwazyjny wzrost guza jest możliwy dzięki oderwaniu się komórek nowotworowych od masy nowotworu w wyniku zmniejszenia lub całkowitej utraty międzykomórkowych cząsteczek adhezyjnych. Dzięki temu komórki nabywają zdolność anomalnie wysokiej ruchliwości umożliwiającej penetrację przez sztywne elementy strukturalne otaczającego zrębu. W tym przypadku proces inwazji w znacznym stopniu obejmuje różne mechanizmy molekularne i komórkowe, które według opublikowanych danych zależą bezpośrednio od innego zjawiska biologicznego – transformacji nabłonkowo-mezenchymalnej, którą po raz pierwszy opisał ED Hay w 1995 roku. -mezenchymalne przejście” (EMT) zostało wykorzystane do wyjaśnienia odwracalności tego procesu. Obecnie wiadomo, że EMT leży u podstaw procesów embriogenezy i zapalenia oraz regeneracji tkanek iz pewnością odgrywa kluczową rolę w mechanizmach kancerogenezy.
Fizjologiczne prototypy wzrostu inwazyjnego
Wiadomo, że komórki nowotworowe rozprzestrzeniające się do otaczających tkanek i odległych narządów odtwarzają mechanizmy i typy migracji charakterystyczne dla normalnych, nienowotworowych komórek podczas procesów fizjologicznych. Komórki nowotworowe, podobnie jak normalne komórki, są w stanie uruchomić te mechanizmy do zmiany własnego kształtu, stworzenia warunków do poruszania się, a także przebudowy otaczających tkanek w celu utworzenia szlaków migracji. Główny problem polega na tym, że komórki nowotworowe, w przeciwieństwie do normalnych komórek, nie mają fizjologicznych „sygnałów zatrzymania” do zakończenia tych procesów. Najprawdopodobniej prowadzi to do powstania mechanizmów migracji i sprzyja progresji i rozprzestrzenianiu się guza.
Stwierdzono, że komórki złośliwe wykorzystują wbudowane programy genetyczne do wdrażania procesów, które determinują inwazyjny wzrost i możliwość przerzutów. Na przykład ruch pojedynczej komórki obserwuje się podczas rozwoju embrionalnego i stanu zapalnego (np. migracji leukocytów). Podobny mechanizm rozsiewania jest typowy dla komórek nowotworowych podczas progresji nowotworu i tworzenia przerzutów.
Wraz z migracją pojedynczych komórek, zbiorowa migracja komórek może wystąpić, gdy migrują grupy mocno połączonych komórek nowotworowych. Ten rodzaj migracji świadczy o rearanżacji tkanek, leży u podstaw procesów morfogenezy embrionalnej, a także jest niezbędnym elementem gojenia się powierzchni rany.
Dlatego kluczowe jest to, że złośliwe komórki nowotworowe szeroko wykorzystują mechanizmy migracji zarówno zbiorczej, jak i pojedynczej komórki jako fizjologiczne prototypy w procesie inwazyjnego wzrostu i przerzutów.
Wzorce wzrostu inwazyjnego
Obecnie na podstawie zespołu pewnych morfologicznych i molekularnych parametrów genetycznych wyróżnia się dwa zasadniczo różne wzorce wzrostu inwazyjnego: zbiorową (grupową) migrację komórek i migrację pojedynczych komórek (migracja indywidualna: ryc. 1). W tym przypadku typ migracji jest w dużej mierze zdeterminowany cechami mikrośrodowiska tkanki i zależy od zmian molekularnych w komórkach nowotworowych.
Określenie mechanizmu inwazji stosowanego przez pojedyncze migrujące komórki podczas migracji jest zadaniem złożonym. Niestety, badań analizujących ten problem na poziomie molekularnym i morfologicznym jest niewiele iw większości przeprowadzono je in vitro z użyciem określonych linii komórkowych.
Jednak obecnie obserwuje się znaczny wzrost liczby badań świadczących o wzroście zainteresowania badaniami nad molekularnymi cechami genetycznymi komórek nowotworowych, które determinują główne różnice między mezenchymalnym i ameboidalnym typem ruchu komórek podczas migracji indywidualnej, a także migracji zbiorowej .
Migracja zbiorowa
Migracja zbiorowa charakteryzuje się migracją całych grup komórek połączonych ze sobą cząsteczkami adhezyjnymi i innymi węzłami komunikacyjnymi (ryc. 1). Jest to główna cecha tego typu inwazji, ponieważ podstawowe mechanizmy komórkowe są tymi samymi kluczowymi procesami, które w dużej mierze determinują migrację pojedynczych komórek.
Zbiorową migrację komórek zaobserwowano w rozwoju i progresji raka piersi i endometrium, raka prostaty, raka jelita grubego, wielkokomórkowego raka płuc, mięśniakomięsaka prążkowanokomórkowego, czerniaka, a także większości raków płaskonabłonkowych.
W przypadku migracji zbiorowej komórki nowotworowe, wchodzące w skład masy guza lub odłączające się od niej w postaci grup wielokomórkowych, penetrują otaczające tkanki i tworzą cienkie krótkie cięciwy, skupiska, paski i szerokie pola oraz struktury ze światłem, które wskazują na szeroką gamę elementów strukturalnych zaangażowanych w inwazję nowotworu.
Jak już wspomniano, migracja zbiorowa charakteryzuje się migracją całych grup komórek połączonych ze sobą kadherynami i międzykomórkowymi połączeniami szczelinowymi. Poruszająca się grupa komórek ma „czołową krawędź” lub „czołowy front”, który wykorzystuje integryny i proteazy (ryc. 1). Badacze wskazują na wyraźne różnice w ekspresji genów i morfologii między komórkami „liderowymi” tworzącymi krawędź natarcia a komórkami „naśladowczymi”, które znajdują się za nimi, na „krawędzi spływu”. „Liderzy” w kształcie komórek często przypominają komórki mezenchymalne i charakteryzują się mniej wyraźnym uporządkowaniem i organizacją strukturalną, podczas gdy „zwolennicy” mają tendencję do tworzenia bardziej ciasno upakowanych, podobnych do rozet struktur rurkowych z ciasnymi kontaktami międzykomórkowymi.
W przypadku migracji zbiorowej komórki nowotworowe tworzą na krawędzi natarcia wypukłości (pseudopodia), wykorzystują integryny do tworzenia ogniskowych kontaktów z cytoszkieletem aktynowym oraz dokonują proteolitycznej degradacji macierzy pozakomórkowej, tworząc przestrzeń do inwazji tkanki nowotworowej i ekstensywnie zaangażowanie aparatu kurczliwego aktyna-miozyna w proces zapewniający pomyślną migrację.
Różnice w polaryzacji grup komórek migrujących zbiorowo wynikają z cech ekspresji receptorów powierzchniowych, takich jak receptory chemokin CXCR4 i CXCR7, w komórkach „liderowych”. Czynniki wzrostu i chemokiny wytwarzane przez komórki zrębowe oraz gradient dyfuzji zapewniają pozakomórkową indukcję polaryzacji komórek. Udział chemokin, takich jak SDF1 (CXCL12), czynnik wzrostu fibroblastów (FGF) i transformujący czynnik wzrostu β (TGF-β), w tych procesach był przedmiotem dyskusji.
Wiele wiadomo na temat udziału TGF-β w karcynogenezie, a jego rola jest dwojaka. Taylora i in. zwrócili uwagę na fakt, że TGF-β, który działa w komórkach nabłonkowych gruczołu sutkowego jako silny supresor nowotworu we wczesnych stadiach raka, może wpływać na rozwój nowotworu poprzez interakcję z cytokinami onkogennymi. Zwiększona ekspresja TGF-β była związana z progresją nowotworu, co często obserwowano np. w późniejszych stadiach raka piersi. Rola TGF-β w migracji nabłonkowo-podścieliskowej podczas progresji nowotworu nie została wystarczająco zbadana. TGF-β ma być kluczowym regulatorem interakcji między guzem a zrębem, co sprzyja zbiorowej migracji komórek w raku piersi.
Ustalono, że komórki liderowe wykazują ekspresję podoplaniny, transbłonowej glikoproteiny, która w normalnych warunkach ulega ekspresji w podocytach nerki, komórkach pęcherzyków płucnych typu 1, komórkach mięśni szkieletowych, łożysku itp. Ekspresja podoplaniny w komórkach raka piersi indukuje migrację komórek i inwazję z tworzenie filopodiów i jednoczesne zachowanie ekspresji ekadheryny.
Zgłaszano dane wskazujące, że zbiorowo migrujące komórki nowotworowe mogą wykorzystywać zdolność sąsiadujących komórek mezenchymalnych do modyfikowania struktury macierzy i odbudowywania jej, a następnie podążania ich „śladami”. W eksperymentach in vitro wprowadzenie fibroblastów do hodowli indukuje zbiorową migrację komórek nowotworowych do podłoża w postaci łańcuchów. Dlatego fibroblasty są „przewodnikiem” w inwazji komórek nowotworowych, przebudowując otaczającą macierz pozakomórkową na ścieżki z grubymi wiązkami kolagenu po bokach i brakiem macierzy w środku.
Kinaza LIM, należąca do jednej z rodzin białek, odgrywa rolę w rozwoju zbiorowej migracji komórek nowotworowych. Wiadomo, że białko to bierze udział w regulacji rozwoju inwadopodiów, struktur typowych dla komórek nowotworowych i odpowiedzialnych za niszczenie otaczającej macierzy zewnątrzkomórkowej. Nadmierna aktywacja kinazy LIM jest widoczna w raku piersi. Komórki guza piersi z tłumioną ekspresją genu kinazy LIM tracą zdolność do inwazji z powodu utraty zdolności do zakłócania macierzy pozakomórkowej.
Inwazja pojedynczych komórek
Taki rodzaj wzrostu inwazyjnego, jak inwazja pojedynczych komórek, zwana także migracją pojedynczych komórek, wyróżnia się na podstawie wykrycia podczas analizy morfologicznej pojedynczych komórek nowotworowych, które niezależnie od siebie atakują otaczające tkanki. W tego typu inwazji nowotworu migracja pojedynczych komórek może zachodzić poprzez dwa różne typy ruchu: mezenchymalny i ameboidalny. Szereg badaczy wskazuje na możliwość „przejścia” z jednego typu migracji na drugi (z mezenchymalnej do ameboidalnej i odwrotnie, ryc. 1) w przypadku inwazji pojedynczych komórek. Przejścia te zwykle zachodzą po zmianach aktywności pewnych cząsteczek komórkowych, gdy komórki nowotworowe muszą przystosować się do osobliwości mikrośrodowiska.
Migracja komórek mezenchymalnych (podobnych do fibroblastów).
Mezenchymalne mechanizmy inwazyjnego wzrostu komórek, w przeciwieństwie do migracji ameboidalnej, charakteryzują się występowaniem bardziej złożonych procesów i koniecznością zaangażowania w ich realizację większej liczby cząsteczek komórkowych (ryc. 1).
Ten typ migracji jest typowy dla keratynocytów podczas regeneracji naprawczej, śródbłonka, komórek mięśni gładkich i fibroblastów . Ponieważ komórki nowotworowe, które wykorzystują ruch mezenchymalny, tracą polaryzację nabłonka i uzyskują wydłużony kształt wrzeciona, który przypomina kształt fibroblastów, inwazja tego typu nazywana jest również migracją „podobną do fibroblastów”. Inwazja mezenchymalna została wykryta podczas rozwoju czerniaka , włókniakomięsaka , glejaka wielopostaciowego i innych nowotworów złośliwych.
Wiadomo, że większość komórek nowotworowych, które odrywają się od masy guza i atakują otaczające tkanki, przechodzi pewne zmiany, nabywając właściwości morfologiczne i fenotyp typowe dla komórek mezenchymalnych. Ta przemiana złośliwej komórki nabłonka, związana z pojawieniem się w komórce nowych cech molekularnych i morfologicznych, została nazwana „przejściem nabłonkowo-mezenchymalnym”. Jak już wspomniano, to biologiczne zjawisko zostało po raz pierwszy opisane przez ED Hay w 1995 roku. Obecnie istnienie tego zjawiska jest poparte wynikami wielu badań, które badały mechanizmy inwazji i przerzutów nowotworów złośliwych. Uważa się, że mezenchymalny mechanizm inwazji jest konsekwencją EMT, gdy dochodzi do aktywnego odróżnicowania złośliwego guza nabłonkowego, a grupy wielokomórkowe zaczynają dzielić się na pojedyncze komórki nowotworowe, uzyskując fenotyp mezenchymalny.
Wielu badaczy podkreśla, że komórki nowotworowe podczas migracji typu mezenchymalnego przechodzą przez szereg określonych kolejnych etapów, które składają się na pięcioetapowy model migracji. Cykl ten obejmuje następujące zmiany: 1) tworzenie się wypukłości na jednym z biegunów komórkowych – lamellipodiów lub filopodiów powstających w wyniku skurczów cytoszkieletu aktynowego pod kontrolą małych GTPaz Rac1 i Cdc42 z szybkim udziałem integryn z rodziny β1 ; 2) występowanie adhezji ogniskowej z udziałem integryn β1 i β3 w miejscu kontaktu między macierzą pozakomórkową a komórką; 3) montaż styków ogniskowych, który opiera się na oddziaływaniach integrynowych i aktywacji enzymów proteolitycznych (metaloproteinazy macierzy, proteazy serynowe i treoninowe, katepsyny) na styku „komórka-macierz”, co prowadzi do zniszczenia i przebudowy otaczającego macierz pozakomórkowa; 4) zmiana polaryzacji cytoszkieletu aktynowego pod kontrolą miozyny II, występowanie skurczów ciał komórkowych; oraz 5) „ciągnięcie” krawędzi spływu w kierunku ruchu przez nowo powstałe defekty w strukturze matrycy. Ponieważ komórki, które wykorzystują mechanizm inwazji podobny do fibroblastów, postępują zgodnie z opisanymi etapami migracji, ich prędkość ruchu jest niska: około 0,1– μm/min.
Możliwość proteolizy i przebudowy struktur tkankowych wyjaśnia fakt, że mezenchymalnemu ruchowi komórki nowotworowej towarzyszą niewielkie zmiany w kształcie komórki, w porównaniu z migracją ameboidalną, oraz minimalna deformacja jądra. Szczególnie interesujące są wyniki badań wskazujące, że zachowanie się komórek nowotworowych podczas migracji indywidualnej zależy od sztywności otaczającej je macierzy. Na przykład mezenchymalny lub proteolityczny model migracji dominuje w warunkach „sztywnej” („gęstej”) otaczającej macierzy. Wysoką wydajność migracji pojedynczej komórki z wykorzystaniem mechanizmu mezenchymalnego w tkankach gęstych tłumaczy się proteolizą w wyniku wydzielania różnych proteaz oraz zdolnością do tworzenia ogniskowych kontaktów z elementami zrębu.
Dlatego warto zauważyć, że kluczowymi punktami fibroblastopodobnego mechanizmu inwazyjnego wzrostu są silne siły adhezji na obu biegunach komórki oraz pomiędzy komórkami a składnikami macierzy pozakomórkowej, wyraźna ekspresja integryn (rodziny β1 i β3), proteoliza z destrukcją i późniejszą przebudową tkanek z powstawaniem defektów w strukturze macierzy i przemieszczaniem się pojedynczej komórki lub łańcuchów komórkowych przez defekty. Deformacja jądra jest minimalna i obserwuje się powolną migrację komórek.
W oparciu o hamowanie ekspresji odpowiednich genów za pomocą małych interferujących RNA wykazano, że specyficzna aktywność GTPaz Rac1 i Cdc42 jest charakterystyczną cechą mezenchymalnego typu inwazji. Supresja GTPazy Rac1 poprzez sygnalizacyjną aktywację GTPazy RhoA i jej efektora, kinazy ROCK, prowadzi do zablokowania mezenchymalnej migracji komórek nowotworowych.
Migracja komórek ameboidalnych
Ameboidalny mechanizm wzrostu inwazyjnego jest najbardziej prymitywnym i jednocześnie najskuteczniejszym sposobem migracji pojedynczych komórek nowotworowych. We wszystkich swoich cechach przypomina zachowanie i ruch organizmów jednokomórkowych, takich jak ameba Dictyostelium discoideum.
Zastosowanie w badaniach klinicznych przeciwciał blokujących integryny lub inhibitorów proteaz prowadzi do powstania komórek nowotworowych o migracji ameboidalnej. Podobne wyniki uzyskano w badaniach nowotworów złośliwych in vivo. Ustalono związek między zastosowaniem leków na bazie inhibitorów metaloproteinaz macierzy w terapii nowotworów a progresją procesu nowotworowego. Wyjaśnienie tego związku stało się możliwe dopiero po zidentyfikowaniu komórek nowotworowych zdolnych do migracji ameboidów. Dane te najprawdopodobniej wskazują, że w warunkach zmniejszenia lub całkowitej utraty zdolności rozprzestrzeniania się do otaczających tkanek za pomocą głównych cząsteczek odpowiedzialnych za adhezję i niszczenie macierzy pozakomórkowej, komórki nowotworowe przechodzą do ameboidalnego mechanizmu inwazji, który staje się jedynym i najskuteczniejszym sposobem migracji.
Ten rodzaj migracji został opisany w krążących komórkach macierzystych, leukocytach i niektórych typach komórek nowotworowych. Według Zijl i wsp. inwazyjny wzrost ameboidalny obserwowano w raku piersi, chłoniaku, drobnokomórkowym raku płuca i raku prostaty oraz czerniaku.
W przypadku migracji ameboidalnej wykazano, że komórki nowotworu złośliwego mają okrągły lub eliptyczny kształt (ryc. 1). Komórki ameboidalne charakteryzują się szybką odkształcalnością, dostosowywaniem swoich kształtów do istniejących struktur otaczającej macierzy pozakomórkowej oraz przenikaniem przez nie wąskimi przestrzeniami w postaci ściśniętej. Ruch i przemieszczanie odbywa się poprzez kolejne szybkie cykle rozszerzania się i kurczenia ciała komórki wraz z rozwojem „pęcherzykowatych” wypustek błony komórkowej. Te pęcherzyki pozwalają komórce zbadać mikrośrodowisko, aby znaleźć najbardziej odpowiednią drogę ruchu, aby ominąć różne przeszkody, dzięki czemu komórki nowotworowe są zdolne do poruszania się przez wąskie szczeliny w macierzy zewnątrzkomórkowej. Rozwijające się zmiany w kształcie komórki są generowane przez korowy cytoszkielet aktynowy, który z kolei jest kontrolowany przez małą GTPazę RhoA i jej efektor, kinazę ROCK. Ta GTPaza należy do nadrodziny małych hydrolaz GTP, których członkowie odgrywają kluczową rolę w inwazji ameboidalnej, ponieważ biorą udział w transdukcji sygnału, a tym samym w regulacji wielu różnych procesów zachodzących w komórce, w tym reorganizacji cytoszkieletu aktynowego podczas migracji.
Warto zauważyć, że migracji poprzez amebowy mechanizm inwazji towarzyszą zmiany nie tylko kształtu komórki, ale także kształtu jądra oraz jego orientacji i położenia względem innych organelli wewnętrznych. Jądro, które jest największe i sztywniejsze w porównaniu z otaczającym go cytoszkieletem, organellą, jest mechanicznie mocno stabilizowane przez rozległą sieć białek strukturalnych iz tego powodu jego kształt najprawdopodobniej często nie ulega znaczącym zmianom. Jednak pełzakowaty typ migracji charakteryzuje się najbardziej wyraźną deformacją jądra, spowodowaną brakiem proteolitycznej degradacji otaczającej macierzy. Ponieważ komórki nowotworowe muszą poruszać się przez wąskie przestrzenie i pory, jądro w tym przypadku również występuje w stanie maksymalnie ściśniętym. Przyjmuje się, że podobnie jak amebowy ruch leukocytów, jądra wewnątrz pojedynczych migrujących komórek nowotworowych poruszają się do przodu w kierunku krawędzi natarcia.
W przeciwieństwie do ruchu mezenchymalnego, pełzakowy lub nieproteolityczny model migracji dominuje, gdy otaczająca macierz charakteryzuje się stosunkowo małą sztywnością („miękka” macierz). Na przykład migrację ameboidalną komórek nowotworowych w układzie limfatycznym i krążeniowym uważa się za migrację w miękkiej macierzy.
Condeelis i Segall wyjaśnili niektóre cechy migracji komórek na przykładzie dwóch różnych linii nowotworowych, MTC i MTLn3, w warunkach in vitro i in vivo. Komórki MTLn3, które mają wysoki potencjał przerzutowy i migrują prawdopodobnie na zasadzie ameboidalnego mechanizmu inwazyjnego wzrostu, charakteryzują się wyższym poziomem ekspresji receptorów naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) niż komórki MTC o niskim potencjale przerzutowym. Ich migracja związana jest z obecnością naczyń krwionośnych i włókien zawierających kolagen w otaczającej macierzy. Uważa się, że chemotaksja komórek nowotworowych w kierunku naczyń krwionośnych odbywa się za pośrednictwem szlaków sygnałowych EGFR.
Ameboidalny mechanizm inwazji ma wiele charakterystycznych cech. Charakteryzuje się słabym oddziaływaniem komórek z otaczającą macierzą oraz brakiem lub słabymi kontaktami ogniskowymi. Odnotowano możliwość zachowania szybkiego i nieogniskowego montażu receptorów w miejscach kontaktu komórki z podłożem zewnątrzkomórkowym. Integryny nie są ważne w tego typu inwazyjnym wzroście. Ważnym aspektem jest brak proteolizy w miejscach interakcji komórka-macierz oraz brak ekspresji enzymów proteolitycznych niszczących macierz zewnątrzkomórkową. Badania in vitro wykazały, że w przypadku inwazyjnego wzrostu typu ameboidalnego prawdopodobnie dzięki tym właściwościom komórki nowotworowe są w stanie poruszać się z największą prędkością w hodowlach (20 μm/min).
Przejścia ameboidalno-mezenchymalne i mezenchymalno-ameboidalne
Zauważyliśmy już istnienie pewnego stopnia plastyczności i możliwości „przejścia” z jednego typu migracji na inny (z typu mezenchymalnego na ameboidalny i odwrotnie) po inwazji poszczególnych komórek. Zdarzenia te są najwyraźniej spowodowane pojawieniem się zmian w aktywności niektórych molekuł komórkowych i koniecznością dostosowania się do warunków mikrośrodowiska tkankowego (ryc. 1).
Zmiany te są opisane jako przejścia ameboidalne-mezenchymalne i mezenchymalne-ameboidalne. Komórki nowotworowe wykorzystujące migrację mezenchymalną mogą w określony sposób zostać zmienione i przejść do ruchu ameboidalnego w warunkach osłabienia sygnału i szlaków mechanicznych, które są bezpośrednio zaangażowane w stabilizację oddziaływań między strukturami macierzy pozakomórkowej a komórkami złośliwymi. Jednak dostępne dane uzyskano przede wszystkim drogą eksperymentów. Opisano następujące mechanizmy prowadzące do przejścia komórek z inwazyjnego typu wzrostu mezenchymalnego do ameboidalnego (przejście mezenchymalne-ameboidalne): 1) ograniczenie lub całkowite zniesienie proteolizy okołokomórkowej w wyniku zastosowania inhibitorów proteazy; 2) zmniejszenie aktywności receptorów integryny i ich interakcji z otaczającymi elementami zrębu przez ich antagonistów; 3) wzrost i stabilizacja aktywności małej GTPazy RhoA i jej efektora ROCK. Badanie przeprowadzone przez grupę S. Bertona dostarczyło interesującego faktu wskazującego, że białko p27, pomimo dużej różnorodności funkcji, odgrywa ważną rolę w kontroli ruchliwości komórek. W szczególności brak tego białka w warunkach in vitro indukuje przejście mezenchymalne-ameboidalne w komórkach w macierzy 3D.
Niektórzy autorzy badający mechanizmy inwazyjnego wzrostu po migracji pojedynczych komórek wskazują na możliwość przejścia ameboidalno-mezenchymalnego, czyli procesu odwrotnego do przejścia mezenchymalamoeboidalnego. Istnieje hipoteza, zgodnie z którą mechanizm przejścia ameboidalno-mezenchymalnego opiera się najprawdopodobniej na tym samym podłożu molekularnym, a jedynym wiarygodnym procesem warunkującym możliwość opisanej transformacji jest zachwianie równowagi w aktywności członków rodziny małych GTPaz i przewaga aktywności Rac nad aktywnością RhoA. Mechanizmy, które mogą leżeć u podstaw opisanych zmian, pozostają niejasne.
Przejścia zbiorowo-indywidualne
Komórki nowotworowe w obrębie pojedynczego guza mogą jednocześnie poruszać się zarówno zbiorowo, jak i indywidualnie. W tym przypadku przejście od migracji indywidualnej do migracji zbiorowej jest ważnym krokiem w kierunku zwiększenia inwazyjnego i metastatycznego potencjału nowotworów złośliwych. Na przykład komórki guza piersi oderwane od masy stałej zyskują zdolność inwazji naczyń limfatycznych. Obecnie wyróżnia się dwa mechanizmy: przejścia nabłonkowo-mezenchymalne i kolektywno-ameboidalne, dzięki którym powstają indywidualnie migrujące komórki nowotworowe (ryc. 1). Z kolei te ostatnie, w szczególności komórki, które przeszły EMT, są zdolne w określonych warunkach do uzyskania fenotypu nabłonkowego i tworzenia nowotworowych kompleksów wielokomórkowych. To odwrócenie fenotypu nazwano „przejściem mezenchymalno-nabłonkowym”.
Przejście nabłonkowo-mezenchymalne
Ostatnio toczy się ożywiona dyskusja na temat przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego jako mechanizmu, podczas którego komórka nowotworowa odłącza się od warstwy nabłonkowej i zyskuje ruchliwość (ryc. 1), tak zwany „fenotyp lokomotoryczny”, który sprzyja inwazyjnemu wzrostowi i przerzutom . Rozwój tego procesu jako kluczowego czynnika progresji nowotworu wykazano in vitro przy użyciu określonych linii nowotworowych oraz modeli eksperymentalnych; jednakże ustalenie rozwoju EMT i identyfikacja komórek nowotworowych oraz ich głównych cech w warunkach in vivo jest zadaniem złożonym.
EMT jest podstawą wielu procesów morfogenezy. Uważa się, że w normalnych warunkach (podczas embriogenezy) EMT może być indukowany przez HGF (czynnik wzrostu hepatocytów) wydzielany przez fibroblasty. HGF wiąże się ze specyficznymi receptorami c-Met znajdującymi się na błonie komórek nabłonka. Wiązanie z receptorami aktywuje szlak sygnałowy z udziałem niektórych białek układu małej GTPazy (Cdc42, Rac, RhoA, RhoC), które regulują intensywność polimeryzacji mikrofilamentów aktyny i kurczliwość filamentów aktyny-miozyny, co determinuje intensywność tworzenia lamellipodiów i napięcie komórki związanej z macierzą. W tym przypadku dochodzi do znacznego przegrupowania całego cytoszkieletu aktynowo-miozynowego i utraty kontaktów międzykomórkowych E-kadheryny. Podczas karcynogenezy komórki nabłonkowe podlegają transformacji morfologicznej, która jest fenotypowo podobna do EMT, ale rozwija się pod nieobecność odpowiedniego ligandu HGF. Ta transformacja w nowotworach złośliwych może być indukowana przez transfekcję różnych onkogenów. Podczas transformacji komórki nowotworowe mogą opuścić warstwę nabłonkową i poruszać się jak fibroblasty, uzyskując w ten sposób zdolność do inwazji i przerzutowania.
Podczas EMT mają miejsce następujące główne zdarzenia: złośliwe komórki nabłonka tracą swoją biegunowość szczytowo-podstawną z powodu przerwania ścisłych połączeń międzykomórkowych i utraty komórkowych cząsteczek adhezyjnych (takich jak E-kadheryna i integryny); komórkowy cytoszkielet aktynowy jest zmieniany i poddawany przebudowie wraz z tworzeniem się włókien stresowych, które gromadzą się w pewnych częściach komórki w pobliżu błony komórkowej, gdzie następnie zaczynają tworzyć się określone wypukłości komórkowe; dochodzi do degradacji leżącej pod spodem błony podstawnej nabłonka, co powoduje, że komórki nowotworowe pozbawione kontaktów międzykomórkowych stają się zdolne do inwazyjnego wzrostu i penetracji do otaczającej macierzy podścieliska oraz rozpoczynają aktywną migrację.
Stwierdzono, że EMT rzadko był jednakowo wyraźny w całej tkance guza. Bardziej prawdopodobne jest, że proces ten charakteryzuje się zmiennym natężeniem przejścia komórek z fenotypu nabłonkowego do mezenchymalnego. W związku z tym niektórzy badacze opisują tzw. częściowe ZRM, w które zaangażowana jest większość komórek frontu inwazyjnego (ryc. 1). Częściowy EMT to stan, w którym komórki uzyskały już właściwości niezbędne do udanej migracji, ale nadal zachowują kontakty komórka-komórka. Fenotyp ten nazwano hybrydowym fenotypem „nabłonkowo-mezenchymalnym” i powiązano go z cechami charakterystycznymi dla kolektywnie przemieszczających się komórek nowotworowych.
Taddei i in. wskazali, że EMT rozwija się dzięki indukcji programów związanych z aktywacją kluczowych czynników transkrypcyjnych, takich jak TWIST1, Snail, Slug i ZEB1/2. Powoduje to rozerwanie silnych połączeń kadherynowych i aktywację migracji komórek polarnych oraz proteolizy składników macierzy zewnątrzkomórkowej przez różne wydzielane proteazy, z zachowaniem funkcji receptorów integrynowych. Eksperymentalnie ustalono rolę czynnika transkrypcyjnego Prrx1, który określa zdolność komórek raka piersi do wzrostu inwazyjnego.
Wykazano, że białka ZEB1 i ZEB2 z domeną palca cynkowego są zdolne do bezpośredniego wiązania się z promotorami, indukując w ten sposób ekspresję mezenchymalnych genów markerowych i hamując ekspresję E-kadheryny i innych markerów nabłonkowych.
Podobnie Ślimak i Ślimak są w stanie tłumić ekspresję genu E-kadheryny poprzez bezpośrednie wiązanie się z jego promotorem, jak również wytwarzanie białek nabłonkowych, takich jak desmoplakina i klaudyna, oraz aktywować ekspresję wimentyny i metaloproteinaz macierzy, zwiększając w ten sposób komórki migracja. Zespół naukowców kierowany przez Sanchez-Tillo odkrył, że czynnik transkrypcyjny Snail nie występuje w normalnych komórkach nabłonkowych i że jego wykrycie w komórkach inwazyjnego frontu nowotworu można uznać za predyktor słabego przeżycia pacjentów z rakiem. Uważa się, że ZEB1/2, Snail i Slug są indukowane przez TGF-β, cytokiny zapalne i niedotlenienie.
Przejście kolektywno-ameboidalne
Na podstawie danych eksperymentalnych wielu badaczy wskazuje na możliwość istnienia tzw. przejścia ameboidalnego kolektywnego (ryc. 1), kiedy to masy nowotworowe naciekające otaczające tkanki w postaci kolektywnych grup wielokomórkowych dysocjują na pojedyncze migrujące komórki wykorzystujące ameboidalny ruch. Wykazano, że zjawisko to stało się możliwe dzięki zastosowaniu inhibitorów receptorów integryny z rodziny β1, ponieważ cząsteczki te odgrywają kluczową rolę zarówno w tworzeniu kontaktów komórka-komórka, jak iw interakcjach między komórkami nowotworowymi a składnikami otaczających tkanek.
Przejście mezenchymalne-nabłonkowe
Właściwie nie ma badań poświęconych badaniu mechanizmów leżących u podstaw przejścia mezenchymalno-nabłonkowego. Uznaje się jednak możliwość wystąpienia takiego zjawiska. W tym przypadku mówi się, że często, np. w raku piersi i prostaty, struktura tkanki w odległych ogniskach przerzutowych jest podobna do struktury guza pierwotnego. Według Friedla i Gilmoura na podstawie tych danych można poczynić kilka założeń. Po pierwsze, inwazja i przerzuty mogą wystąpić bez EMT. Po drugie, wykrycie pojedynczych rozsianych komórek podczas rutynowego badania histopatologicznego próbek tkanki nowotworowej wydaje się być dość złożonym zadaniem, a identyfikacja tych komórek podczas EMT jest właściwie niemożliwa. I po trzecie, komórki nowotworowe tymczasowo wykorzystują mechanizmy EMT do inwazji i rozprzestrzeniania się do odległych narządów i tkanek, gdzie powracają do fenotypu nabłonkowego. Ta transformacja jest opisana jako przejście mezenchymalne-nabłonkowe (MET). MET został wywołany eksperymentalnie, a indywidualnie poruszające się komórki tworzyły kompleksy wielokomórkowe, ale mechanizmy molekularne MET w warunkach fizjologicznych pozostają nieznane. Nguyen i in. wykazali, że selektywny inhibitor PD173074 receptora czynnika wzrostu fibroblastów 1 (FGFR1) hamuje szlak sygnałowy MAPK regulujący aktywność białka AP-1, co z kolei indukuje rozwój MET. Badanie możliwości zastosowania inhibitora PD173074 jako leku, które przeprowadzono na określonych liniach komórek nowotworowych, wykazało wyraźne zahamowanie wzrostu, zdolności migracji i inwazji guza. W tym przypadku zaobserwowano spadek ekspresji genów Snail i metaloproteinazy macierzy 3, 10, 12 i 13 oraz wzrost ekspresji genu E-kadheryny.
Klasyfikacja inwazyjnych typów rozrostu na przykładzie raka piersi
Nasz zespół badawczy od wielu lat bada cechy progresji raka piersi w zależności od heterogeniczności wewnątrz guza. Szczególną uwagę zwrócono na zróżnicowanie fenotypowe guza pierwotnego w raku inwazyjnym bez specjalnego typu, który stanowi większość (80%) wszystkich typów histologicznych raka piersi.
Pomimo znacznego zróżnicowania strukturalnego pierwotnego guza piersi można wyróżnić pięć głównych typów struktur morfologicznych: struktury pęcherzykowe, beleczkowate, cylindryczne i lite oraz odrębne grupy komórek nowotworowych (ryc. 2). Struktury pęcherzykowe to skupiska komórek nowotworowych o okrągłym lub lekko nieregularnym kształcie. Morfologia komórek tworzących tego typu struktury waha się od małych komórek o umiarkowanej cytoplazmie i okrągłych jądrach do dużych komórek z hiperchromatycznymi jądrami o nieregularnym kształcie i umiarkowanej cytoplazmie. Struktury beleczkowe są albo krótkimi, liniowymi asocjacjami utworzonymi przez pojedynczy rząd małych, raczej monomorficznych komórek, albo szerokie skupiska komórek składające się z dwóch rzędów komórek średniej wielkości z umiarkowaną cytoplazmą i okrągłymi normochromicznymi lub hiperchromatycznymi jądrami. Struktury rurkowe są utworzone przez jeden lub dwa rzędy raczej monomorficznych komórek z okrągłymi normochromicznymi jądrami. Struktury stałe to pola o różnych rozmiarach i kształtach, składające się albo z małych komórek z umiarkowaną cytoplazmą i jądrami monomorficznymi, albo z dużych komórek z obfitą cytoplazmą i jądrami polimorficznymi. Dyskretne grupy komórek występują w postaci skupisk od jednej do czterech komórek o różnej morfologii.
Na podstawie dotychczas zgromadzonych danych można przypuszczać, że różnym typom inwazji odpowiadają różne struktury morfologiczne guzów piersi. Dlatego struktury pęcherzykowe, beleczkowate i lite, które charakteryzują się obecnością kontaktów komórka-komórka, można odnieść do morfologicznych przejawów migracji zbiorowej, podczas gdy odrębne grupy komórek nowotworowych można odnieść do przejawów migracji indywidualnej. Co ciekawe, pierwsza partia danych uzyskanych w badaniu ekspresji genów adhezji komórkowej w pełni potwierdza tę hipotezę. Na przykład nastąpił spadek aktywności genów kadheryn, które odpowiadają za kontakty komórka-komórka, w kolejności: lite – struktury pęcherzykowe i beleczkowate – odrębne grupy komórek nowotworowych. W tym przypadku zmniejszono liczbę eksprymowanych genów integryn zaangażowanych w adhezję komórek nowotworowych do macierzy pozakomórkowej w kolejności: lite i pęcherzykowe – struktury beleczkowate – odrębne grupy komórek nowotworowych.
Rodzaje wzrostu inwazyjnego w progresji nowotworu i skuteczności terapii
Inwazyjny wzrost i rozwój lekooporności to powiązane procesy, które odgrywają najważniejszą rolę w progresji nowotworu, w szczególności w przerzutach. Jest bardzo prawdopodobne, że te same szlaki sygnałowe są zaangażowane w migrację komórek i rozwój oporności guza na terapię.
Migrujące komórki nowotworowe (niezależnie od rodzaju ruchu) są bardziej odporne na chemioterapię i radioterapię niż komórki nieruchome. Wynika to w dużej mierze z faktu, że migrujące komórki tymczasowo tracą zdolność do podziału. Faktem jest również, że poruszające się komórki nowotworowe wykazują zwiększoną aktywność genów antyapoptotycznych, co powoduje oporność na leki chemioterapeutyczne mające na celu indukcję programowanej śmierci komórki. Ponadto wiadomo, że komórki w stanie EMT wykazują również oporność na chemioterapię. Ta lekooporność jest spowodowana indukcją podczas EMT syntezy białek rodziny ABC odpowiedzialnych za wypływ leków chemioterapeutycznych z komórki. Do głównych czynników transkrypcyjnych, które wyzwalają EMT i jednocześnie pozytywnie regulują aktywność transporterów ABC, należą TWIST1, Snail itp.
Uzyskane ostatnio dane wskazują na silny związek między migracją zbiorową a opornością na radioterapię i chemioterapię. Według badań własnych guzy piersi zawierające zarówno struktury pęcherzykowe, jak i beleczkowate, a także wykazujące znaczne zróżnicowanie morfologiczne, charakteryzują się zwiększoną lekoopornością. Co ciekawe, udział struktur beleczkowatych w chemooporności prawdopodobnie tłumaczy się wysoką aktywnością transporterów ABC w komórkach nowotworowych danego wariantu morfologicznego. Natomiast oporność guzów piersi zawierających strukturę wyrostka zębodołowego tłumaczy się innymi, jeszcze niezidentyfikowanymi przyczynami.
Inwazyjny wzrost i jego różnorodność fenotypowa są związane, zarówno bezpośrednio, jak i poprzez rozwój lekooporności, z przerzutami. Krążące komórki nowotworowe, odpowiedzialne za rozwój przyszłych przerzutów, są wynikiem inwazji i późniejszej penetracji komórek nowotworowych do naczyń limfatycznych lub krwionośnych. Nie tylko pojedyncze migrujące komórki nowotworowe, ale także grupy komórek mogą mieć zdolność inwasacji. Istnieje przypuszczenie, że migracje zbiorowe znacznie częściej prowadzą do przerzutów niż migracje indywidualne. Pionierskie badania na modelach zwierzęcych wykazały, że przerzuty częściej powstają po dożylnym wstrzyknięciu skupisk guzów niż pojedynczych komórek nowotworowych. Ponadto we krwi pacjentów z różnymi nowotworami wykryto skupiska krążących komórek nowotworowych. Przyjęto, że zbiorcza innaczynienie jest związana z zależnym od VEGF tworzeniem rozszerzonych naczyń i akumulacją wewnątrznaczyniowych skupisk guzów. Ponadto grupy komórek nowotworowych mogą dostać się do krążenia przez uszkodzone naczynia lub poprzez współpracę z komórkami w stanie EMT i związanymi z rakiem fibroblastami, które niszczą macierz zewnątrzkomórkową przez proteazy. Zależność przerzutów od migracji zbiorowych potwierdzają wyniki badań własnych. Na przykład obecność struktur pęcherzykowych w guzach u pacjentek po menopauzie z rakiem piersi wiąże się z wysokim odsetkiem przerzutów limfogennych, podczas gdy ryzyko tego typu progresji u kobiet przed menopauzą wzrasta wraz ze wzrostem liczby różnych typów struktur morfologicznych. Ta ostatnia zależność ma również charakter ilościowy: przerzuty limfogenne wykrywano częściej w przypadku większej liczby struktur pęcherzykowych w guzach piersi. Ponadto pacjenci ze strukturami pęcherzykowymi w guzach mieli niski wskaźnik przeżycia bez przerzutów (dane własne, niepublikowane).
Ustalony związek między strukturami pęcherzyków płucnych, jako jednym z przejawów migracji zbiorowej, a tempem przerzutów limfogennych i krwiotwórczych pozwala na postawienie następujących założeń. Najwyraźniej elementy komórkowe struktur pęcherzykowych różnią się od komórek nowotworowych innych struktur zestawem właściwości biologicznych determinujących fenotyp przerzutowy. Wyraźniejszy związek między strukturami pęcherzykowymi a przerzutami limfogennymi w okresie menopauzy sugeruje pewną rolę estrogenów, w tym także ich produkcję in situ, polegającą na tym, że komórki nowotworowe struktur pęcherzykowych uzyskują fenotyp przerzutowy drogą limfogenną.
Dlatego dostępne obecnie dane dotyczące cech inwazyjnego wzrostu raków o różnej lokalizacji, a w szczególności raka piersi, stwarzają nowe możliwości badania wzorców progresji nowotworu i poszukiwania dodatkowych kluczowych parametrów rokowania i być może „kontroli ” postępu choroby.
In situ a inwazyjne
Na podstawie stopnia inwazji rak można sklasyfikować jako in situ , gdy komórki złośliwe są obecne jako guz, ale nie dają przerzutów ani nie naciekają poza warstwę lub rodzaj tkanki, w której powstały. Na przykład rak pochodzenia nabłonkowego z takimi cechami nazywany jest rakiem in situ i jest definiowany jako nienaciekający poza błonę podstawną . W przeciwieństwie do tego rak inwazyjny zaatakował poza błonę podstawną.
Wnioski
Znaczenie badań nad morfologicznymi objawami i molekularnymi mechanizmami genetycznymi inwazji i przerzutów nowotworów złośliwych nie budzi wątpliwości. Wyniki licznych badań wyraźnie wskazują, że migracja komórek nowotworowych podczas inwazyjnego wzrostu może zachodzić zarówno poprzez pojedyncze komórki, jak i grupy komórek. Ta różnorodność typów migracji komórek prawdopodobnie prowadzi do rozwoju heterogeniczności wewnątrz guza, która jest reprezentowana, np. w raku piersi, przez różne struktury morfologiczne: struktury pęcherzykowe, beleczkowate i lite oraz odrębne grupy komórek nowotworowych. Znanych jest wiele biochemicznych i molekularnych mechanizmów genetycznych, które umożliwiają złośliwym komórkom inwazję otaczających tkanek i uzyskanie zdolności do rozprzestrzeniania się daleko poza pierwotne miejsce guza, powodując rozwój wtórnych ognisk przerzutowych w odległych narządach i tkankach. Jednak pomimo osiągniętego postępu pozostają nierozpoznane pytania dotyczące możliwego związku między różnymi typami inwazyjnego wzrostu komórek a parametrami przerzutów limfogennych i hematogennych, cechami progresji choroby, a także skutecznością wybranej terapii. Rozwiązanie tych problemów może być bardzo pomocne w określeniu rokowania choroby i być może w opracowaniu nowych podejść do leczenia pacjentów z rakiem.
Skróty
EMT przejście nabłonkowo-mezenchymalne MET przejście mezenchymalne-nabłonkowe GTPazy trifosfatazy guanozyny
Zobacz też