Replikacja eukariotycznego DNA
Replikacja eukariotycznego DNA jest konserwatywnym mechanizmem, który ogranicza replikację DNA do jednej na cykl komórkowy. Replikacja eukariotycznego DNA chromosomalnego DNA ma kluczowe znaczenie dla duplikacji komórki i jest niezbędna do utrzymania genomu eukariotycznego .
Replikacja DNA to działanie polimeraz DNA syntetyzujących nić DNA komplementarną do oryginalnej nici matrycy. Aby zsyntetyzować DNA, dwuniciowy DNA jest rozwijany przez helikazy DNA przed polimerazami, tworząc widełki replikacyjne zawierające dwie jednoniciowe matryce. Procesy replikacji umożliwiają kopiowanie pojedynczej podwójnej helisy DNA do dwóch helis DNA, które w mitozie dzielą się na komórki potomne . Główne funkcje enzymatyczne przeprowadzane w widełkach replikacyjnych są dobrze zachowane od prokariotów do eukariotów , ale mechanizm replikacji w eukariotycznej replikacji DNA jest znacznie większym kompleksem, koordynującym wiele białek w miejscu replikacji, tworzącym replisom .
Replosom jest odpowiedzialny za kopiowanie całości genomowego DNA w każdej komórce proliferacyjnej. Proces ten pozwala na bardzo wierne przekazywanie informacji dziedzicznej/genetycznej z komórki rodzicielskiej do komórki potomnej, a zatem jest niezbędny dla wszystkich organizmów. Duża część cyklu komórkowego opiera się na zapewnieniu bezbłędnej replikacji DNA.
W fazie G 1 cyklu komórkowego inicjowanych jest wiele procesów regulacyjnych replikacji DNA. U eukariontów zdecydowana większość syntezy DNA zachodzi w fazie S cyklu komórkowego, a cały genom musi zostać rozwinięty i zduplikowany, aby utworzyć dwie kopie potomne. Podczas G 2 wszelkie uszkodzone DNA lub błędy replikacji są korygowane. Na koniec jedna kopia genomów jest rozdzielana na każdą komórkę potomną w mitozie lub fazie M. Każda z tych kopii potomnych zawiera jedną nić z rodzicielskiego dupleksu DNA i jedną rodzącą się nić antyrównoległą.
Mechanizm ten jest zachowany od prokariotów do eukariontów i jest znany jako semikonserwatywna replikacja DNA. Proces półkonserwatywnej replikacji miejsca replikacji DNA jest strukturą DNA przypominającą widełki, widełki replikacyjne, w których helisa DNA jest otwarta lub rozwinięta, eksponując niesparowane nukleotydy DNA do rozpoznania i parowania zasad w celu włączenia wolnych nukleotydów do podwójnych - nici DNA.
Inicjacja
Inicjacja replikacji eukariotycznego DNA jest pierwszym etapem syntezy DNA, w którym podwójna helisa DNA jest rozwijana, a na nici wiodącej zachodzi wstępne zdarzenie torowania przez polimerazę DNA α. Zdarzenie torujące na nici opóźnionej ustanawia widełki replikacyjne. Przygotowanie helisy DNA polega na syntezie startera RNA umożliwiającego syntezę DNA przez polimerazę DNA α. Startowanie zachodzi raz na początku nici wiodącej i na początku każdego fragmentu Okazaki na nici opóźnionej.
Replikacja DNA jest inicjowana z określonych sekwencji zwanych miejscami inicjacji replikacji , a komórki eukariotyczne mają wiele miejsc inicjacji replikacji. Aby zainicjować replikację DNA, wiele replikujących się białek gromadzi się i dysocjuje z tych replikacyjnych miejsc startowych. Poszczególne czynniki opisane poniżej współpracują ze sobą, kierując tworzeniem kompleksu przedreplikacyjnego (pre-RC), kluczowego elementu pośredniego w procesie inicjacji replikacji.
Powiązanie kompleksu rozpoznawania pochodzenia (ORC) z początkiem replikacji rekrutuje białko cyklu podziału komórkowego 6 (Cdc6) w celu utworzenia platformy do ładowania białek kompleksu utrzymania minichromosomu (Mcm 2-7) , ułatwione przez licencjonowanie chromatyny i DNA białko czynnika replikacji 1 (Cdt1). ORC, Cdc6 i Cdt1 razem są wymagane do stabilnej asocjacji kompleksu Mcm2-7 z miejscami replikacji podczas fazy G1 cyklu komórkowego.
Kompleks przedreplikacyjny
Eukariotyczne początki replikacji kontrolują tworzenie szeregu kompleksów białkowych, które prowadzą do złożenia dwóch dwukierunkowych widełek replikacyjnych DNA. Zdarzenia te są inicjowane przez utworzenie kompleksu przedreplikacyjnego (pre-RC) na początku replikacji. Proces ten zachodzi w fazie G 1 cyklu komórkowego. Tworzenie pre-RC obejmuje uporządkowany montaż wielu czynników replikacyjnych, w tym kompleksu rozpoznawania miejsca pochodzenia (ORC), białka Cdc6, białka Cdt1 i białek podtrzymujących minichromosom (Mcm2-7). Po utworzeniu pre-RC aktywacja kompleksu jest wyzwalana przez dwie kinazy , kinazę zależną od cyklin 2 (CDK) i kinazę zależną od Dbf4 (DDK), które pomagają w przejściu pre-RC do kompleksu inicjującego przed rozpoczęciem Replikacja DNA. To przejście obejmuje uporządkowany montaż dodatkowych czynników replikacyjnych w celu rozwinięcia DNA i zgromadzenia wielu eukariotycznych polimeraz DNA wokół rozwiniętego DNA. Centralnym elementem pytania o to, w jaki sposób dwukierunkowe widełki replikacyjne są ustanawiane na początku replikacji, jest mechanizm, za pomocą którego ORC rekrutuje dwa bezpośrednie kompleksy Mcm2-7 do każdego początku replikacji, tworząc kompleks przed replikacją.
Kompleks rozpoznawania pochodzenia
Pierwszym krokiem w składaniu kompleksu przed replikacją (pre-RC) jest powiązanie kompleksu rozpoznawania pochodzenia (ORC) z początkiem replikacji. W późnej mitozie białko Cdc6 przyłącza się do związanego ORC, po czym następuje wiązanie kompleksu Cdt1-Mcm2-7. ORC, Cdc6 i Cdt1 są wymagane do załadowania kompleksu podtrzymującego sześć minichromosomów białkowych (Mcm 2-7) na DNA. ORC to kompleks białkowy składający się z sześciu podjednostek, Orc1p-6, który wybiera miejsca inicjacji replikacji w DNA w celu zainicjowania replikacji, a wiązanie ORC z chromatyną jest regulowane w cyklu komórkowym. Ogólnie rzecz biorąc, funkcja i rozmiar podjednostek ORC są zachowane w wielu genomach eukariotycznych, z tą różnicą, że ich rozbieżne miejsca wiązania DNA.
Najszerzej badanym kompleksem rozpoznającym miejsce pochodzenia jest kompleks Saccharomyces cerevisiae lub drożdży, o którym wiadomo, że wiąże się z sekwencją replikującą się autonomicznie (ARS). ORC S. cerevisiae oddziałuje specyficznie zarówno z elementami A, jak i B1 miejsc inicjacji replikacji drożdży, obejmując region o długości 30 par zasad . Wiązanie z tymi sekwencjami wymaga ATP .
Określono strukturę atomową ORC S. cerevisiae związanego z DNA ARS. Orc1, Orc2, Orc3, Orc4 i Orc5 otaczają element A za pomocą dwóch rodzajów interakcji, nieswoistych dla zasad i specyficznych dla zasad, które zaginają DNA w elemencie A. Wszystkie pięć podjednostek styka się ze szkieletem fosforanu cukru w wielu punktach elementu A, tworząc ciasny uchwyt bez specyficzności zasad. Orc1 i Orc2 stykają się z mniejszym rowkiem elementu A, podczas gdy domena uskrzydlonej helisy Orc4 styka się z grupami metylowymi niezmiennych Ts w głównym rowku elementu A poprzez helisę insercyjną (IH). Brak tego IH u metazoanów wyjaśnia brak specyficzności sekwencji w ludzkim ORC. Usunięcie IH z Sc ORC powoduje, że traci on swoistość dla elementu A i wiąże się swobodnie i preferencyjnie (83%) z regionami promotorowymi. DNA ARS jest również wygięte w elemencie B1 poprzez interakcje z Orc2, Orc5 i Orc6. Wydaje się, że zginanie pierwotnego DNA przez ORC jest ewolucyjnie konserwowane, co sugeruje, że może być wymagane dla złożonego mechanizmu ładowania Mcm2-7.
Kiedy ORC wiąże się z DNA na początku replikacji, służy jako rusztowanie do montażu innych kluczowych czynników inicjacyjnych kompleksu przedreplikacyjnego. To przedreplikacyjne złożenie kompleksu podczas etapu G1 cyklu komórkowego jest wymagane przed aktywacją replikacji DNA podczas fazy S. Usunięcie przynajmniej części kompleksu (Orc1) z chromosomu w metafazie jest częścią regulacji ORC ssaków, aby zapewnić wyeliminowanie tworzenia kompleksu przed replikacją przed zakończeniem metafazy.
białko cdc6
Wiązanie białka cyklu podziału komórkowego 6 (Cdc6) z kompleksem rozpoznawania miejsca pochodzenia (ORC) jest istotnym etapem składania kompleksu przed replikacją (pre-RC) w miejscu początku replikacji. Cdc6 wiąże się z ORC na DNA w sposób zależny od ATP, co indukuje zmianę wzoru wiązania pochodzenia, która wymaga ATPazy Orc1 . Cdc6 wymaga ORC, aby związać się z chromatyną i jest z kolei wymagane, aby heptamer Cdt1-Mcm2-7 związał się z chromatyną. Kompleks ORC-Cdc6 tworzy strukturę pierścieniową i jest analogiczny do innych maszyn białkowych zależnych od ATP. Poziomy i aktywność Cdc6 regulują częstotliwość, z jaką miejsca inicjacji replikacji są wykorzystywane podczas cyklu komórkowego.
białko cdt1
Licencjonowanie chromatyny i czynnik replikacji DNA 1 (Cdt1) jest wymagane do licencjonowania chromatyny do replikacji DNA. W S. cerevisiae Cdt1 ułatwia ładowanie kompleksu Mcm2-7 pojedynczo na chromosom poprzez stabilizację lewoskrętnej struktury otwartego pierścienia pojedynczego heksameru Mcm2-7. Wykazano, że Cdt1 wiąże się z końcem C Cdc6, aby wspólnie promować asocjację białek Mcm z chromatyną. Struktura krio-EM kompleksu OCCM (ORC-Cdc6-Cdt1-MCM) pokazuje, że Cdt1-CTD oddziałuje z Mcm6-WHD. U metazoanów aktywność Cdt1 podczas cyklu komórkowego jest ściśle regulowana przez jej powiązanie z białkiem geminina , które zarówno hamuje aktywność Cdt1 podczas fazy S, aby zapobiec ponownej replikacji DNA, jak i zapobiega ubikwitynacji i późniejszej proteolizie .
Kompleks białek podtrzymujących minichromosomy
Białka podtrzymujące minichromosom (Mcm) zostały nazwane na cześć genetycznego przesiewu mutantów inicjujących replikację DNA w S. cerevisiae , które wpływają na stabilność plazmidu w sposób specyficzny dla ARS . Mcm2, Mcm3, Mcm4, Mcm5, Mcm6 i Mcm7 tworzą heksameryczny kompleks, który ma strukturę otwartego pierścienia z przerwą między Mcm2 i Mcm5. Montaż białek Mcm na chromatynie wymaga skoordynowanej funkcji kompleksu rozpoznawania pochodzenia (ORC), Cdc6 i Cdt1. Po załadowaniu białek Mcm na chromatynę, ORC i Cdc6 można usunąć z chromatyny bez zapobiegania późniejszej replikacji DNA. Ta obserwacja sugeruje, że podstawową rolą kompleksu przedreplikacyjnego jest prawidłowe ładowanie białek Mcm.
Białka Mcm na chromatynie tworzą podwójny heksamer typu „łeb w łeb” z dwoma pierścieniami lekko pochylonymi, skręconymi i przesuniętymi względem środka, aby utworzyć załamanie w kanale centralnym, w którym związane DNA jest wychwytywane na styku dwóch pierścieni. Każdy heksameryczny pierścień Mcm2-7 służy najpierw jako rusztowanie do montażu replisomu, a następnie jako rdzeń katalitycznej helikazy CMG (Cdc45-MCM-GINS), która jest głównym składnikiem replisomu. Każde białko Mcm jest wysoce spokrewnione ze wszystkimi innymi, ale unikalne sekwencje wyróżniające każdy z typów podjednostek są zachowane u eukariontów. Wszystkie eukarionty mają dokładnie sześć analogów białek Mcm, z których każdy należy do jednej z istniejących klas (Mcm2-7), co wskazuje, że każde białko Mcm ma wyjątkową i ważną funkcję.
Białka podtrzymujące minichromosomy są wymagane do aktywności helikazy DNA. Inaktywacja któregokolwiek z sześciu białek Mcm podczas fazy S nieodwracalnie zapobiega dalszemu postępowi widełek replikacyjnych, co sugeruje, że helikaza nie może zostać poddana recyklingowi i musi zostać złożona w miejscu rozpoczęcia replikacji. Wraz z aktywnością helikazy kompleksu białka podtrzymującego minichromosom, kompleks ma również powiązaną aktywność ATPazy. Badania wykazały, że w kompleksie białkowym Mcm znajdują się specyficzne pary katalityczne białek Mcm, które wspólnie koordynują hydrolizę ATP. Badania te, potwierdzone strukturami krio-EM kompleksów Mcm2-7, wykazały, że kompleks Mcm jest heksamerem z podjednostkami ułożonymi w pierścień w kolejności Mcm2-Mcm6-Mcm4-Mcm7-Mcm3-Mcm5-. Obaj członkowie każdej pary katalitycznej przyczyniają się do konformacji, która umożliwia wiązanie ATP i hydrolizę, a mieszanina aktywnych i nieaktywnych podjednostek przypuszczalnie umożliwia heksamerycznemu kompleksowi Mcm całkowite wiązanie ATP i hydrolizę jako całość, aby stworzyć skoordynowaną aktywność ATPazy.
Lokalizacja jądrowa białek podtrzymujących minichromosom jest regulowana w pączkujących komórkach drożdży. Białka Mcm są obecne w jądrze w fazie G1 i fazie S cyklu komórkowego, ale są eksportowane do cytoplazmy podczas fazy G2 i fazy M. Kompletny i nienaruszony kompleks sześciu podjednostek Mcm jest wymagany do wejścia do jądra komórkowego. W S. cerevisiae eksport jądrowy jest promowany przez aktywność kinazy cyklinozależnej (CDK). Białka Mcm, które są związane z chromatyną, są chronione przed maszynami eksportującymi CDK z powodu braku dostępu do CDK.
Kompleks inicjacyjny
Podczas etapu G 1 cyklu komórkowego czynniki inicjacji replikacji, kompleks rozpoznający miejsce pochodzenia (ORC), Cdc6, Cdt1 i kompleks białka podtrzymującego minichromosom (Mcm) wiążą się sekwencyjnie z DNA, tworząc dimer typu „head-to-head” Kompleks pierścieniowy MCM, znany jako kompleks przedreplikacyjny (pre-RC). Podczas gdy pre-RC drożdży tworzy zamknięty kompleks DNA, ludzki pre-RC tworzy kompleks otwarty. Podczas przejścia z fazy G 1 do fazy S cyklu komórkowego, specyficzna dla fazy S kinaza białkowa cyklinozależna (CDK) i kinaza Cdc7/Dbf4 (DDK) przekształcają obojętny pre-RC w aktywny kompleks zdolny do składania dwa dwukierunkowe replisomy. Struktury CryoEM pokazały, że dwa DDK niezależnie dokują do interfejsu podwójnego heksameru MCM leżącego okrakiem na dwóch pierścieniach. Sekwencyjną fosforylację wielu substratów na NTE Mcm4, Mcm2 i Mcm6 osiąga się za pomocą mechanizmu kołysania, w którym Dbf4 przyjmuje różne stany kołysania, aby ustawić Cdc7 na wielu substratach. Fosforylacja podwójnego heksameru MCM, w szczególności Mcm4-NSD, przez DDK jest niezbędna dla żywotności drożdży. Rekrutacja Cdc45 i GINS następuje po aktywacji MCM przez DDK i CDK.
białko cdc45
cyklu podziału komórkowego 45 (Cdc45) jest kluczowym składnikiem konwersji kompleksu przedreplikacyjnego do kompleksu inicjacyjnego. Białko Cdc45 gromadzi się na początku replikacji przed inicjacją i jest wymagane do rozpoczęcia replikacji w Saccharomyces cerevisiae i odgrywa zasadniczą rolę podczas wydłużania. Zatem Cdc45 odgrywa centralną rolę zarówno w fazie inicjacji, jak i wydłużania replikacji chromosomalnego DNA.
Cdc45 wiąże się z chromatyną po rozpoczęciu inicjacji w późnym stadium G1 i podczas fazy S cyklu komórkowego. Cdc45 fizycznie łączy się z Mcm5 i wykazuje interakcje genetyczne z pięcioma z sześciu członków rodziny genów Mcm i ORC2 . Ładowanie Cdc45 na chromatynę ma kluczowe znaczenie dla ładowania innych różnych białek replikacyjnych, w tym polimerazy DNA α , polimerazy DNA ε, białka replikacyjnego A (RPA) i antygenu jądrowego komórek proliferujących (PCNA) na chromatynę. Wykazano, że w systemie bezjądrowym Xenopus Cdc45 jest wymagany do rozwijania plazmidowego DNA. System bezjądrowy Xenopus pokazuje również, że rozwijanie DNA i ścisłe wiązanie RPA z chromatyną zachodzi tylko w obecności Cdc45.
Wiązanie Cdc45 z chromatyną zależy od aktywności kinazy Clb-Cdc28, jak również funkcjonalnych Cdc6 i Mcm2, co sugeruje, że Cdc45 wiąże się z pre-RC po aktywacji kinaz zależnych od cyklin fazy S (CDK). Jak wskazuje czas i zależność od CDK, wiązanie Cdc45 z chromatyną ma kluczowe znaczenie dla zaangażowania w inicjację replikacji DNA. Podczas fazy S Cdc45 fizycznie oddziałuje z białkami Mcm na chromatynie; jednakże dysocjacja Cdc45 z chromatyny jest wolniejsza niż dysocjacja Mcm, co wskazuje, że białka są uwalniane przez różne mechanizmy.
GIN
Sześć białek podtrzymujących minichromosomy i Cdc45 są niezbędne podczas inicjacji i wydłużania dla ruchu widełek replikacyjnych i rozwijania DNA. GINS są niezbędne do interakcji Mcm i Cdc45 na początku replikacji podczas inicjacji, a następnie w widełkach replikacyjnych DNA w miarę postępu replisomu. Kompleks GINS składa się z czterech małych białek Sld5 (Cdc105), Psf1 (Cdc101), Psf2 (Cdc102) i Psf3 (Cdc103), GINS reprezentuje „go, ichi, ni, san”, co oznacza „5, 1, 2, 3 ' po japońsku. Cdc45, Mcm2-7 i GINS razem tworzą helikazę CMG, replikacyjną helikazę replisomu. Chociaż sam kompleks Mcm2-7 ma słabą aktywność helikazy, Cdc45 i GINS są wymagane do silnej aktywności helikazy
Mcm10
Mcm10 jest niezbędny do replikacji chromosomów i wchodzi w interakcje z helikazą utrzymującą minichromosom 2-7, która jest ładowana w nieaktywnej formie na początku replikacji DNA. Mcm10 jest również opiekunem katalitycznej polimerazy DNA α i pomaga stabilizować polimerazę w widełkach replikacyjnych.
Kinazy DDK i CDK
Na początku fazy S kompleks przedreplikacyjny musi zostać aktywowany przez dwie kinazy specyficzne dla fazy S, aby utworzyć kompleks inicjacyjny w miejscu startu replikacji. Jedna kinaza to kinaza Cdc7-Dbf4 zwana kinazą zależną od Dbf4 (DDK), a druga to kinaza zależna od cyklin (CDK). Testy wiązania chromatyny przez Cdc45 w drożdżach i Xenopus wykazały, że dalszym zdarzeniem działania CDK jest ładowanie Cdc45 na chromatynę. Spekulowano, że Cdc6 jest celem działania CDK, ze względu na związek między Cdc6 i CDK oraz zależną od CDK fosforylację Cdc6. Uważa się, że fosforylacja Cdc6 zależna od CDK jest wymagana do wejścia w fazę S.
Zarówno katalityczne podjednostki DDK, Cdc7, jak i białko aktywatorowe, Dbf4, są konserwowane u eukariontów i są wymagane do rozpoczęcia fazy S cyklu komórkowego. Zarówno Dbf4, jak i Cdc7 są wymagane do załadowania Cdc45 na miejsca inicjacji replikacji chromatyny. Celem wiązania kinazy DDK jest związana z chromatyną postać kompleksu Mcm. Struktury CryoEM o wysokiej rozdzielczości wykazały, że podjednostka Dbf4 DDK leży okrakiem w poprzek interfejsu heksameru MCM-DH związanego z DNA, kontaktując się z Mcm2 jednego heksameru i Mcm4/6 przeciwnego heksameru. Mcm2, Mcm4 i Mcm6 są wszystkimi substratami fosforylacji przez DDK, ale tylko N-końcowa domena bogata w serynę / treoninę (NSD) Mcm4 jest niezbędnym celem DDK. Fosforylacja NSD prowadzi do aktywacji aktywności helikazy Mcm.
Białka Dpb11, Sld3 i Sld2
Sld3, Sld2 i Dpb11 oddziałują z wieloma białkami replikacyjnymi. Sld3 i Cdc45 tworzą kompleks, który wiąże się z pre-RC we wczesnych miejscach inicjacji replikacji nawet w fazie G11 iz późniejszymi inicjacjami replikacji w fazie S w sposób wzajemnie zależny od Mcm. Dpb11 i Sld2 oddziałują z polimerazą ɛ, a eksperymenty z sieciowaniem wykazały, że Dpb11 i polimeraza ɛ współwytrącają się w fazie S i łączą się z początkiem replikacji.
Sld3 i Sld2 są fosforylowane przez CDK, co umożliwia dwóm replikującym się białkom wiązanie się z Dpb11. Dpb11 miał dwie pary domen BRCA1 C-końcowych (BRCT), które są znane jako domeny wiążące fosfopeptyd. N-końcowa para domen BRCT wiąże się z fosforylowanym Sld3, a para C-końcowa wiąże się z fosforylowanym Sld2. Obie te interakcje są niezbędne do zależnej od CDK aktywacji pączkowania DNA w drożdżach.
Dpb11 oddziałuje również z GINS i uczestniczy w etapach inicjacji i wydłużania replikacji chromosomalnego DNA. GINS to jedno z białek replikacyjnych znajdujących się w widełkach replikacyjnych i tworzy kompleks z Cdc45 i Mcm.
Te zależne od fosforylacji interakcje między Dpb11, Sld2 i Sld3 są niezbędne do zależnej od CDK aktywacji replikacji DNA, a dzięki zastosowaniu odczynników sieciujących w niektórych eksperymentach zidentyfikowano delikatny kompleks zwany kompleksem wstępnego ładowania (pre-LC) . Ten kompleks zawiera Pol ɛ, GINS, Sld2 i Dpb11. Stwierdzono, że pre-LC tworzy się przed jakimkolwiek skojarzeniem z początkiem w sposób zależny od CDK i DDK, a aktywność CDK reguluje inicjację replikacji DNA poprzez tworzenie pre-LC.
Wydłużenie
Tworzenie kompleksu przedreplikacyjnego (pre-RC) oznacza potencjalne miejsca inicjacji replikacji DNA. Zgodnie z kompleksem podtrzymującym minichromosom otaczającym dwuniciowy DNA, tworzenie pre-RC nie prowadzi do natychmiastowego odwijania pierwotnego DNA ani rekrutacji polimeraz DNA. Zamiast tego pre-RC, które powstaje podczas G1 cyklu komórkowego, jest aktywowane tylko w celu rozwinięcia DNA i zainicjowania replikacji po przejściu komórek z fazy G1 do fazy S cyklu komórkowego.
Po utworzeniu kompleksu inicjacyjnego i przejściu komórek do fazy S kompleks staje się replisomem. Eukariotyczny kompleks replisomów jest odpowiedzialny za koordynację replikacji DNA. Replikacja na nici wiodącej i opóźnionej jest przeprowadzana przez polimerazę DNA ε i polimerazę DNA δ. Wiele czynników replisomów, w tym Claspin, And1, czynnik replikacyjny C clamp loader i kompleks ochrony widełek, jest odpowiedzialnych za regulację funkcji polimerazy i koordynację syntezy DNA z rozwijaniem nici matrycy przez kompleks Cdc45-Mcm-GINS. W miarę rozwijania DNA liczba skrętów maleje. Aby to zrekompensować, skrętów wzrasta, wprowadzając dodatnie superskręty w DNA. Te supercewki spowodowałyby zatrzymanie replikacji DNA, gdyby nie zostały usunięte. Topoizomerazy są odpowiedzialne za usuwanie tych supercewek przed widełkami replikacyjnymi.
Replosom jest odpowiedzialny za kopiowanie całego genomowego DNA w każdej komórce proliferacyjnej. Reakcje parowania zasad i tworzenia łańcuchów, które tworzą helisę potomną, są katalizowane przez polimerazy DNA. Enzymy te poruszają się wzdłuż jednoniciowego DNA i pozwalają na wydłużenie powstającej nici DNA poprzez „odczyt” nici matrycy i umożliwienie włączenia odpowiednich zasad nukleinowych puryn , adeniny i guaniny oraz zasad nukleotydów pirymidynowych , tyminy i cytozyny . Aktywowane wolne dezoksyrybonukleotydy występują w komórce jako trójfosforany dezoksyrybonukleotydów (dNTP). Te wolne nukleotydy są dodawane do eksponowanej grupy 3'-hydroksylowej na ostatnim włączonym nukleotydzie. W tej reakcji pirofosforan jest uwalniany z wolnego dNTP, wytwarzając energię do reakcji polimeryzacji i odsłaniając monofosforan 5', który jest następnie kowalencyjnie związany z tlenem 3'. Dodatkowo, nieprawidłowo wstawione nukleotydy mogą zostać usunięte i zastąpione prawidłowymi nukleotydami w energetycznie korzystnej reakcji. Ta właściwość jest niezbędna do prawidłowej korekty i naprawy błędów, które występują podczas replikacji DNA.
Widelec replikacyjny
Widełki replikacyjne to połączenie między nowo rozdzielonymi nićmi matrycy, znanymi jako nić wiodąca i nić opóźniona, a dwuniciowym DNA. Ponieważ dupleks DNA jest antyrównoległy, replikacja DNA zachodzi w przeciwnych kierunkach między dwiema nowymi niciami w widełkach replikacyjnych, ale wszystkie polimerazy DNA syntetyzują DNA w kierunku od 5 'do 3' w stosunku do nowo zsyntetyzowanej nici. Podczas replikacji DNA wymagana jest dalsza koordynacja. Dwie replikacyjne polimerazy syntetyzują DNA w przeciwnych orientacjach. Polimeraza ε syntetyzuje DNA na „wiodącej” nici DNA w sposób ciągły, ponieważ jest skierowana w tym samym kierunku, co DNA rozwijany przez replisom. W przeciwieństwie do tego polimeraza δ syntetyzuje DNA na nici „opóźnionej”, która jest przeciwną nicią matrycy DNA, w sposób fragmentaryczny lub nieciągły.
Nieciągłe odcinki produktów replikacji DNA na nici opóźnionej są znane jako fragmenty Okazaki i mają długość około 100 do 200 zasad w eukariotycznych widełkach replikacyjnych. Nić opóźniona zwykle zawiera dłuższe odcinki jednoniciowego DNA, który jest pokryty jednoniciowymi białkami wiążącymi, które pomagają stabilizować jednoniciowe matryce, zapobiegając tworzeniu się struktury drugorzędowej. U eukariontów te jednoniciowe białka wiążące są heterotrimerycznym kompleksem znanym jako białko replikacyjne A (RPA).
Każdy fragment Okazaki jest poprzedzony starterem RNA, który jest wypierany przez procesję kolejnego fragmentu Okazaki podczas syntezy. RNaza H rozpoznaje hybrydy DNA:RNA, które są tworzone przy użyciu starterów RNA i jest odpowiedzialna za usuwanie ich z replikowanej nici, pozostawiając połączenie starter:matryca. Polimeraza DNA α rozpoznaje te miejsca i wydłuża przerwy pozostawione przez usunięcie startera. W komórkach eukariotycznych niewielka ilość segmentu DNA bezpośrednio powyżej startera RNA jest również przemieszczana, tworząc strukturę klapową. Ta klapka jest następnie rozcinana przez endonukleazy. W widełkach replikacyjnych przerwa w DNA po usunięciu płatka jest uszczelniana przez ligazę DNA I , która naprawia nacięcia pozostawione między 3'-OH a 5'fosforanem nowo zsyntetyzowanej nici. Ze względu na stosunkowo krótki charakter eukariotycznego fragmentu Okazaki, synteza replikacji DNA zachodząca w sposób nieciągły na nici opóźnionej jest mniej wydajna i bardziej czasochłonna niż synteza nici wiodącej. Synteza DNA jest zakończona, gdy wszystkie startery RNA zostaną usunięte, a nacięcia zostaną naprawione.
Prowadząc nić
Podczas replikacji DNA, replisom rozwinie macierzysty dupleks DNA w dwa jednoniciowe widełki replikacyjne matrycy DNA w kierunku od 5 'do 3'. Wiodąca nić to nić szablonu, która jest replikowana w tym samym kierunku, co ruch widełek replikacyjnych. Pozwala to na syntezę nowo zsyntetyzowanej nici komplementarnej do oryginalnej nici od 5' do 3' w tym samym kierunku co ruch widełek replikacyjnych.
Gdy starter RNA zostanie dodany przez prymazę do końca 3' nici wiodącej, synteza DNA będzie kontynuowana w kierunku od 3' do 5' w stosunku do nici wiodącej nieprzerwanie. Polimeraza DNA ε będzie w sposób ciągły dodawać nukleotydy do nici matrycy, dzięki czemu synteza nici wiodącej wymaga tylko jednego startera i ma nieprzerwaną aktywność polimerazy DNA.
Opóźniona nić
Replikacja DNA na nici opóźnionej jest nieciągła. W syntezie nici opóźnionej ruch polimerazy DNA w kierunku przeciwnym do widełek replikacyjnych wymaga użycia wielu starterów RNA . Polimeraza DNA syntetyzuje krótkie fragmenty DNA zwane fragmentami Okazaki , które są dodawane na końcu 3' startera. Te fragmenty mogą mieć długość od 100 do 400 nukleotydów u eukariontów.
Pod koniec syntezy fragmentu Okazaki, polimeraza DNA δ wpada na poprzedni fragment Okazaki i zastępuje jego koniec 5' zawierający starter RNA i mały segment DNA. Powoduje to utworzenie płatka pojedynczej nici RNA-DNA, który należy rozciąć, a nacięcie między dwoma fragmentami Okazaki musi zostać uszczelnione przez ligazę DNA I. Proces ten jest znany jako dojrzewanie fragmentu Okazaki i można go obsługiwać na dwa sposoby: jeden mechanizm procesów krótkie klapy, podczas gdy druga zajmuje się długimi klapami. Polimeraza DNA δ jest w stanie przemieścić do 2 do 3 nukleotydów DNA lub RNA przed jego polimeryzacją, generując krótki substrat „klapki” dla Fen1 , który może usuwać nukleotydy z klapki, po jednym nukleotydzie na raz.
Powtarzając cykle tego procesu, polimeraza DNA δ i Fen1 mogą koordynować usuwanie starterów RNA i pozostawiać nacięcie DNA na opóźnionej nici. Zaproponowano, że ten proces iteracyjny jest lepszy niż komórka, ponieważ jest ściśle regulowany i nie generuje dużych płatów, które należy wyciąć. W przypadku rozregulowanej aktywności polimerazy Fen1/DNA δ komórka wykorzystuje alternatywny mechanizm generowania i przetwarzania długich płatów przy użyciu Dna2, który ma zarówno aktywność helikazy, jak i nukleazy. Aktywność nukleazy Dna2 jest wymagana do usunięcia tych długich płatów, pozostawiając krótszy płat do przetworzenia przez Fen1. mikroskopii elektronowej wskazują, że ładowanie nukleosomu na nici opóźnionej zachodzi bardzo blisko miejsca syntezy. Zatem dojrzewanie fragmentu Okazaki jest wydajnym procesem, który zachodzi natychmiast po zsyntetyzowaniu powstającego DNA.
Replikacyjne polimerazy DNA
Po tym, jak replikacyjna helikaza rozwinie dupleks rodzicielskiego DNA, odsłaniając dwie jednoniciowe matryce DNA, do wytworzenia dwóch kopii genomu rodzicielskiego potrzebne są polimerazy replikacyjne. Funkcja polimerazy DNA jest wysoce wyspecjalizowana i zapewnia replikację na określonych szablonach i w wąskich lokalizacjach. W eukariotycznym widełkach replikacyjnych znajdują się trzy odrębne replikacyjne kompleksy polimerazy, które przyczyniają się do replikacji DNA: polimeraza α, polimeraza δ i polimeraza ε. Te trzy polimerazy są niezbędne dla żywotności komórki.
Ponieważ polimerazy DNA wymagają startera, na którym można rozpocząć syntezę DNA, polimeraza α (Pol α) działa jako prymaza replikacyjna. Pol α jest związana z prymazą RNA i ten kompleks realizuje zadanie primowania poprzez syntezę startera, który zawiera krótki 10-nukleotydowy odcinek RNA, po którym następuje 10 do 20 zasad DNA. Co ważne, to działanie torujące zachodzi podczas inicjacji replikacji na początku, aby rozpocząć syntezę nici wiodącej, a także na końcu 5' każdego fragmentu Okazaki na nici opóźnionej.
Jednak Pol α nie jest w stanie kontynuować replikacji DNA i musi zostać zastąpiona inną polimerazą, aby kontynuować syntezę DNA. Przełączanie polimerazy wymaga ładowarek zaciskowych i udowodniono, że normalna replikacja DNA wymaga skoordynowanych działań wszystkich trzech polimeraz DNA: Pol α do syntezy starterów, Pol ε do replikacji nici wiodącej i Pol δ, która jest stale ładowana, do generowania Fragmenty Okazaki podczas syntezy nici opóźnionej.
- Polimeraza α (Pol α) : Tworzy kompleks z małą podjednostką katalityczną (PriS) i dużą podjednostką niekatalityczną (PriL). Po pierwsze, synteza startera RNA umożliwia syntezę DNA przez polimerazę DNA alfa. Występuje raz na początku na nici wiodącej i na początku każdego fragmentu Okazaki na nici opóźnionej. Podjednostki Pri działają jak prymasy, syntetyzując starter RNA. DNA Pol α wydłuża nowo utworzony starter o nukleotydy DNA. Po około 20 nukleotydach wydłużenie przejmuje Pol ε na nici wiodącej i Pol δ na nici opóźnionej.
- Polimeraza δ (Pol δ) : Wysoce procesowa i ma aktywność korekty, egzonukleazy 3'->5'. In vivo jest główną polimerazą zaangażowaną zarówno w syntezę nici opóźnionej, jak i nici wiodącej.
- Polimeraza ε (Pol ε) : Wysoce procesowa i ma aktywność egzonukleazy 3'->5'. Wysoce spokrewniony z pol δ, in vivo działa głównie w sprawdzaniu błędów pol δ.
Kompleks helikazy Cdc45 – Mcm – GINS
Helikazy DNA i polimerazy muszą pozostawać w bliskim kontakcie na widełkach replikacyjnych. Jeśli rozwijanie następuje zbyt daleko przed syntezą, odsłaniane są duże połacie jednoniciowego DNA. Może to aktywować sygnalizację uszkodzenia DNA lub wywołać procesy naprawy DNA. Aby udaremnić te problemy, eukariotyczny replisom zawiera wyspecjalizowane białka, które mają regulować aktywność helikazy przed widełkami replikacyjnymi. Białka te zapewniają również miejsca dokowania dla fizycznych interakcji między helikazami i polimerazami, zapewniając w ten sposób, że odwijanie dupleksu jest sprzężone z syntezą DNA.
Aby polimerazy DNA działały, dwuniciowa helisa DNA musi zostać rozwinięta, aby odsłonić dwie jednoniciowe matryce DNA do replikacji. Helikazy DNA są odpowiedzialne za rozwijanie dwuniciowego DNA podczas replikacji chromosomu. Helikazy w komórkach eukariotycznych są niezwykle złożone. Rdzeń katalityczny helikazy składa się z sześciu białek podtrzymujących minichromosom (Mcm2-7), tworzących heksameryczny pierścień. Z dala od DNA białka Mcm2-7 tworzą pojedynczy heteroheksamer i są ładowane w nieaktywnej formie na początku replikacji DNA jako podwójne heksamery typu „łeb w łeb” wokół dwuniciowego DNA. Białka Mcm są rekrutowane do miejsc startu replikacji, a następnie redystrybuowane w genomowym DNA podczas fazy S, co wskazuje na ich lokalizację w widełkach replikacyjnych.
Ładowanie białek Mcm może wystąpić tylko podczas G1 cyklu komórkowego, a obciążony kompleks jest następnie aktywowany podczas fazy S poprzez rekrutację białka Cdc45 i kompleksu GINS, tworząc aktywną helikazę Cdc45–Mcm–GINS (CMG) w widełki replikacyjne DNA. Aktywność Mcm jest wymagana przez całą fazę S do replikacji DNA. Różnorodne czynniki regulacyjne gromadzą się wokół helikazy CMG, tworząc „kompleks progresji replisomu”, który wiąże się z polimerazami DNA, tworząc eukariotyczny replisom, którego struktura jest wciąż dość słabo zdefiniowana w porównaniu z jego bakteryjnym odpowiednikiem.
Wyizolowana helikaza CMG i Replisome Progression Complex zawierają pojedynczy kompleks pierścieni białkowych Mcm, co sugeruje, że obciążony podwójny heksamer białek Mcm na początku może zostać rozbity na dwa pojedyncze pierścienie heksameryczne w ramach procesu inicjacji, przy czym każdy pierścień kompleksu białkowego Mcm tworzy rdzeń helikazy CMG w dwóch widełkach replikacyjnych ustanowionych z każdego miejsca pochodzenia. Pełny kompleks CMG jest wymagany do rozwijania DNA, a kompleks CDC45-Mcm-GINS jest funkcjonalną helikazą DNA w komórkach eukariotycznych.
Białka Ctf4 i And1
Kompleks CMG oddziałuje z replisomem poprzez interakcję z białkami Ctf4 i And1. Białka Ctf4/And1 oddziałują zarówno z kompleksem CMG, jak i polimerazą DNA α. Ctf4 jest czynnikiem pomocniczym polimerazy α, który jest wymagany do rekrutacji polimerazy α do miejsc inicjacji replikacji.
Białka Mrc1 i Claspin
Białka Mrc1/Claspin łączą syntezę nici wiodących z aktywnością złożonej helikazy CMG. Mrc1 oddziałuje z polimerazą ε oraz białkami Mcm. Znaczenie tego bezpośredniego powiązania między helikazą a polimerazą nici wiodącej podkreślają wyniki hodowli ludzkich komórek, w których Mrc1 / Claspin jest wymagany do wydajnej progresji widełek replikacyjnych. Wyniki te sugerują, że wydajna replikacja DNA wymaga również sprzężenia helikaz i syntezy nici wiodących…
Proliferujący antygen jądrowy komórki
Polimerazy DNA wymagają dodatkowych czynników wspierających replikację DNA. Polimerazy DNA mają półzamkniętą strukturę „ręki”, która umożliwia polimerazie ładowanie się do DNA i rozpoczęcie translokacji. Ta struktura pozwala polimerazie DNA na utrzymanie jednoniciowej matrycy DNA, włączenie dNTP w miejscu aktywnym i uwolnienie nowo utworzonego dwuniciowego DNA. Jednak struktura polimeraz DNA nie pozwala na ciągłą stabilną interakcję z matrycowym DNA.
Aby wzmocnić interakcję między polimerazą a matrycowym DNA, przesuwne klamry DNA łączą się z polimerazą, aby promować procesywność polimerazy replikacyjnej. U eukariontów suwak przesuwny jest strukturą pierścieniową homotrimeru, znaną jako antygen jądrowy proliferującej komórki (PCNA). Pierścień PCNA ma polaryzację z powierzchniami, które oddziałują z polimerazami DNA i bezpiecznie wiążą je z matrycą DNA. Zależna od PCNA stabilizacja polimeraz DNA ma znaczący wpływ na replikację DNA, ponieważ PCNA są w stanie zwiększyć procesowość polimerazy nawet 1000-krotnie. PCNA jest niezbędnym kofaktorem i wyróżnia się tym, że jest jedną z najczęstszych platform interakcji w replisomie, aby pomieścić wiele procesów w widełkach replikacyjnych, dlatego PCNA jest również postrzegany jako kofaktor regulacyjny dla polimeraz DNA.
współczynnik replikacji C
PCNA całkowicie otacza nić matrycy DNA i musi zostać załadowana na DNA w widełkach replikacyjnych. Na nici wiodącej ładowanie PCNA jest procesem rzadkim, ponieważ replikacja DNA na nici wiodącej jest ciągła, aż do zakończenia replikacji. Jednak na nici opóźnionej polimeraza DNA δ musi być stale ładowana na początku każdego fragmentu Okazaki. Ta ciągła inicjacja syntezy fragmentu Okazaki wymaga wielokrotnego ładowania PCNA w celu wydajnej replikacji DNA.
Ładowanie PCNA jest realizowane przez kompleks czynnika replikacji C (RFC). Kompleks RFC składa się z pięciu ATPaz: Rfc1, Rfc2, Rfc3, Rfc4 i Rfc5. RFC rozpoznaje połączenia primer-matryca i ładuje PCNA w tych miejscach. Homotrimer PCNA jest otwierany przez RFC przez hydrolizę ATP, a następnie ładowany na DNA w odpowiedniej orientacji, aby ułatwić jego połączenie z polimerazą. Ładowarki zaciskowe mogą również rozładowywać PCNA z DNA; mechanizm potrzebny, gdy replikacja musi zostać zakończona.
Zablokowany widelec replikacyjny
Replikacja DNA w widełkach replikacyjnych może zostać zatrzymana przez niedobór trójfosforanów dezoksynukleotydów (dNTP) lub przez uszkodzenie DNA, co skutkuje stresem replikacyjnym . To zatrzymanie replikacji jest opisane jako zablokowane rozwidlenie replikacji . Kompleks białek chroniących widełki stabilizuje widełki replikacyjne do czasu naprawienia uszkodzeń DNA lub innych problemów związanych z replikacją. Przedłużające się zatrzymanie widełek replikacyjnych może prowadzić do dalszych uszkodzeń DNA. Sygnały przeciągnięcia są dezaktywowane, jeśli problemy powodujące rozwidlenie replikacyjne zostaną rozwiązane.
Zakończenie
Zakończenie replikacji eukariotycznego DNA wymaga różnych procesów w zależności od tego, czy chromosomy są okrągłe, czy liniowe. W przeciwieństwie do cząsteczek liniowych, koliste chromosomy są w stanie replikować całą cząsteczkę. Jednak dwie cząsteczki DNA pozostaną ze sobą połączone. Ten problem jest rozwiązany przez dekatenację dwóch cząsteczek DNA przez topoizomerazę typu II . Topoizomerazy typu II są również używane do rozdzielania nici liniowych, ponieważ są one misternie sfałdowane w nukleosom w komórce.
Jak wspomniano wcześniej, liniowe chromosomy napotykają inny problem, którego nie widać w kolistej replikacji DNA. Ze względu na fakt, że do zainicjowania syntezy DNA wymagany jest starter RNA, nić opóźniona jest w niekorzystnej sytuacji w replikacji całego chromosomu. Podczas gdy nić wiodąca może wykorzystywać pojedynczy starter RNA do przedłużenia końca 5' replikującej nici DNA, wiele starterów RNA jest odpowiedzialnych za syntezę nici opóźnionej, tworząc fragmenty Okazaki. Prowadzi to do problemu ze względu na fakt, że polimeraza DNA jest w stanie dodać tylko do końca 3' nici DNA. Działanie polimerazy DNA 3'-5' wzdłuż nici macierzystej pozostawia krótki region jednoniciowego DNA (ssDNA) na końcu 3' nici macierzystej, gdy fragmenty Okazaki zostały naprawione. Ponieważ replikacja zachodzi w przeciwnych kierunkach na przeciwnych końcach chromosomów rodzicielskich, każda nić jest nicią opóźnioną na jednym końcu. Z biegiem czasu doprowadziłoby to do stopniowego skracania obu chromosomów potomnych . Jest to znane jako problem z replikacją końcową.
Problem replikacji końca jest rozwiązywany w komórkach eukariotycznych przez regiony telomerów i telomerazę . Telomery rozciągają koniec 3' chromosomu rodzicielskiego poza koniec 5' nici potomnej. Ta jednoniciowa struktura DNA może działać jako początek replikacji, która rekrutuje telomerazę. Telomeraza to wyspecjalizowana polimeraza DNA, która składa się z wielu podjednostek białkowych i składnika RNA. Składnik RNA telomerazy przyłącza się do jednoniciowego końca 3' matrycy DNA i zawiera 1,5 kopii sekwencji telomerowej. Telomeraza zawiera podjednostkę białkową, która jest odwrotną transkryptazą zwaną odwrotną transkryptazą telomerazy lub TERT. TERT syntetyzuje DNA do końca matrycowego RNA telomerazy, a następnie odłącza się. Proces ten można powtarzać tyle razy, ile potrzeba, z przedłużeniem końca 3' macierzystej cząsteczki DNA. To dodanie 3' zapewnia matrycę do wydłużania końca 5' nici potomnej przez syntezę DNA nici opóźnionej. Regulacją aktywności telomerazy zajmują się białka wiążące telomery.
Bariery widełek replikacyjnych
Replikacja prokariotycznego DNA jest dwukierunkowa; w obrębie replikacyjnego początku, kompleksy replisomów są tworzone na każdym końcu początku replikacji, a replisomy oddalają się od siebie od początkowego punktu początkowego. U prokariontów replikacja dwukierunkowa rozpoczyna się w jednym miejscu replikacji na chromosomie kolistym i kończy się w miejscu przeciwległym do początkowego początku pochodzenia. Te regiony terminacji mają sekwencje DNA znane jako Ter . Te Ter są związane przez białko Tus. Kompleks Ter -Tus jest w stanie zatrzymać aktywność helikazy, kończąc replikację.
W komórkach eukariotycznych zakończenie replikacji następuje zwykle w wyniku zderzenia dwóch widełek replikacyjnych między dwoma aktywnymi miejscami startu replikacji. Lokalizacja kolizji różni się w zależności od czasu wystrzelenia. W ten sposób, jeśli widełki replikacyjne utkną w martwym punkcie lub załamią się w określonym miejscu, replikację miejsca można uratować, gdy replisom podróżujący w przeciwnym kierunku zakończy kopiowanie regionu. Istnieją zaprogramowane bariery widełek replikacyjnych (RFB) związane przez białka RFB w różnych miejscach w całym genomie, które są w stanie zakończyć lub wstrzymać widełki replikacyjne, zatrzymując progresję replisomu.
Fabryki replik
Stwierdzono, że replikacja zachodzi w sposób zlokalizowany w jądrze komórkowym. W przeciwieństwie do tradycyjnego poglądu o przesuwaniu widełek replikacyjnych wzdłuż zastoju DNA, pojawiła się koncepcja fabryk replikacyjnych , co oznacza, że widełki replikacyjne są skoncentrowane w niektórych unieruchomionych regionach „fabrycznych”, przez które nici matrycy DNA przechodzą jak przenośniki taśmowe.
Regulacja cyklu komórkowego
Replikacja DNA jest ściśle zorganizowanym procesem kontrolowanym w ramach cyklu komórkowego . Przebieg cyklu komórkowego iz kolei replikacja DNA jest ściśle regulowana przez tworzenie i aktywację kompleksów przedreplikacyjnych (pre-RC), co osiąga się poprzez aktywację i inaktywację kinaz zależnych od cyklin (Cdks, CDK). W szczególności to interakcje cyklin i kinaz zależnych od cyklin są odpowiedzialne za przejście z fazy G1 do fazy S.
Podczas fazy G1 cyklu komórkowego występują niskie poziomy aktywności CDK. Ten niski poziom aktywności CDK pozwala na tworzenie nowych kompleksów pre-RC, ale nie jest wystarczający do zainicjowania replikacji DNA przez nowo utworzone pre-RC. Podczas pozostałych faz cyklu komórkowego dochodzi do podwyższonego poziomu aktywności CDK. Ten wysoki poziom aktywności CDK jest odpowiedzialny za inicjowanie replikacji DNA, jak również hamowanie tworzenia nowego kompleksu pre-RC. Po zainicjowaniu replikacji DNA kompleks pre-RC ulega rozkładowi. Ze względu na fakt, że poziomy CDK pozostają wysokie podczas faz S, G2 i M cyklu komórkowego, nie mogą tworzyć się nowe kompleksy pre-RC. Wszystko to pomaga zapewnić, że żadna inicjacja nie może nastąpić, dopóki podział komórki nie zostanie zakończony.
Uważa się, że oprócz kinaz zależnych od cyklin, nowa runda replikacji jest zapobiegana poprzez obniżenie poziomu Cdt1. Osiąga się to poprzez degradację Cdt1, jak również poprzez działanie hamujące białka znanego jako geminina . Geminina ściśle wiąże się z Cdt1 i uważa się, że jest głównym inhibitorem ponownej replikacji. Geminina pojawia się po raz pierwszy w fazie S i ulega degradacji w przejściu metafaza-anafaza, prawdopodobnie w wyniku ubiquination przez kompleks promujący anafazę (APC).
0 W trakcie cyklu komórkowego obecne są różne punkty kontrolne cyklu komórkowego, które określają, czy komórka całkowicie przejdzie przez podział. Co ważne w replikacji, punkt kontrolny G1 lub restrykcja określa, czy rozpocznie się inicjacja replikacji lub czy komórka zostanie umieszczona w stanie spoczynku znanym jako G. 0 Komórki na etapie G cyklu komórkowego nie mogą rozpocząć rundy replikacji, ponieważ białka podtrzymujące minichromosomy nie ulegają ekspresji. Przejście do fazy S wskazuje, że replikacja się rozpoczęła.
Białka punktów kontrolnych replikacji
Aby zachować informację genetyczną podczas podziału komórki, replikacja DNA musi być zakończona z dużą dokładnością. Aby wykonać to zadanie, komórki eukariotyczne mają białka na miejscu w pewnych punktach procesu replikacji, które są w stanie wykryć wszelkie błędy podczas replikacji DNA i są w stanie zachować integralność genomu. Te białka punktów kontrolnych są w stanie zatrzymać mitozę w cyklu komórkowym, aby dać czas na naprawę DNA. Białka punktów kontrolnych biorą również udział w niektórych szlakach naprawy DNA, jednocześnie stabilizując strukturę widełek replikacyjnych, aby zapobiec dalszym uszkodzeniom. Te białka punktów kontrolnych są niezbędne, aby uniknąć przekazywania mutacji lub innych aberracji chromosomowych potomstwu.
Białka eukariotycznych punktów kontrolnych są dobrze konserwowane i obejmują dwie kinazy związane z 3-kinazą fosfatydyloinozytolu (PIKK), ATR i ATM . Zarówno ATR, jak i ATM mają wspólną docelową sekwencję fosforylacji, motyw SQ/TQ, ale ich indywidualne role w komórkach są różne.
ATR bierze udział w zatrzymaniu cyklu komórkowego w odpowiedzi na pęknięcia dwuniciowe DNA. ATR ma obowiązkowego partnera w punkcie kontrolnym, białko oddziałujące z ATR (ATRIP), i razem te dwa białka reagują na odcinki jednoniciowego DNA, które są pokryte białkiem replikacyjnym A (RPA). Tworzenie jednoniciowego DNA zachodzi często, częściej podczas stresu replikacyjnego. ATR-ATRIP jest w stanie zatrzymać cykl komórkowy, aby zachować integralność genomu. ATR znajduje się na chromatynie podczas fazy S, podobnie jak RPA i claspin.
Generowanie jednoniciowych ciągów DNA jest ważne w inicjowaniu szlaków punktów kontrolnych poniżej uszkodzenia replikacyjnego. Gdy jednoniciowy DNA stanie się wystarczająco długi, jednoniciowy DNA opłaszczony RPA jest w stanie rekrutować ATR-ATRIP. Aby stać się w pełni aktywną, kinaza ATR opiera się na białkach czujnikowych, które wykrywają, czy białka punktu kontrolnego są zlokalizowane w ważnym miejscu stresu replikacyjnego DNA. RAD9 - HUS1 - Rad1 (9-1-1) heterotrimeryczny zacisk i RFC jego moduł ładujący Rad17 są w stanie rozpoznać przerwane lub nacięte DNA. Ładowarka zaciskowa RFC Rad17 ładuje 9-1-1 do uszkodzonego DNA. Obecność 9-1-1 na DNA wystarcza do ułatwienia interakcji między ATR-ATRIP a grupą białek zwanych mediatorami punktów kontrolnych, takich jak TOPBP1 i Mrc1/ claspin . TOPBP1 oddziałuje i rekrutuje fosforylowany składnik Rad9 9-1-1 i wiąże ATR-ATRIP, który fosforyluje Chk1. Mrc1 / Claspin jest również wymagany do całkowitej aktywacji ATR-ATRIP, który fosforyluje Chk1, główną kinazę efektorową punktu kontrolnego w dół. Claspin jest składnikiem replisomu i zawiera domenę do dokowania z Chk1, ujawniając specyficzną funkcję Claspin podczas replikacji DNA: promowanie sygnalizacji punktu kontrolnego w replisomie.
Chk1 jest niezbędna do zatrzymania cyklu komórkowego i zapobiegania wejściu komórek w mitozę z niepełną replikacją DNA lub uszkodzeniem DNA. Zależne od Chk1 hamowanie Cdk jest ważne dla funkcji punktu kontrolnego ATR-Chk1 i zatrzymania cyklu komórkowego oraz zapewnienia wystarczającego czasu na zakończenie mechanizmów naprawy DNA, co z kolei zapobiega dziedziczeniu uszkodzonego DNA. Ponadto zależne od Chk1 hamowanie Cdk odgrywa kluczową rolę w hamowaniu odpalania pochodzenia podczas fazy S. Mechanizm ten zapobiega ciągłej syntezie DNA i jest niezbędny do ochrony genomu w obecności stresu replikacyjnego i potencjalnych warunków genotoksycznych. Zatem aktywność ATR-Chk1 dalej zapobiega potencjalnym problemom z replikacją na poziomie pojedynczych miejsc inicjacji replikacji poprzez hamowanie inicjacji replikacji w całym genomie, aż do wyłączenia kaskady sygnalizacyjnej utrzymującej zatrzymanie cyklu komórkowego.
Replikacja przez nukleosomy
Eukariotyczny DNA musi być ciasno zagęszczony, aby zmieścił się w ograniczonej przestrzeni jądra. Chromosomy są pakowane przez owinięcie 147 nukleotydów wokół oktameru histonowych , tworząc nukleosom . Oktamer nukleosomu zawiera po dwie kopie każdego histonu H2A , H2B , H3 i H4 . Ze względu na ścisłe powiązanie białek histonowych z DNA, komórki eukariotyczne mają białka zaprojektowane do przebudowy histonów przed widełkami replikacyjnymi, aby umożliwić płynną progresję replisomu. Istnieją również białka zaangażowane w ponowne składanie histonów za widełkami replikacyjnymi w celu przywrócenia konformacji nukleosomu.
Istnieje kilka białek opiekuńczych histonów, o których wiadomo, że biorą udział w składaniu nukleosomów po replikacji. Stwierdzono, że kompleks FACT oddziałuje z kompleksem α-primazy polimerazy DNA, a podjednostki kompleksu FACT oddziałują genetycznie z czynnikami replikacyjnymi. Kompleks FACT jest heterodimerem, który nie hydrolizuje ATP, ale jest w stanie ułatwić „rozluźnienie” histonów w nukleosomach, ale sposób, w jaki kompleks FACT jest w stanie złagodzić ścisłe powiązanie histonów w celu usunięcia DNA, pozostaje bez odpowiedzi.
Innym chaperonem histonu, który wiąże się z replisomem, jest Asf1 , który oddziałuje z kompleksem Mcm zależnym od dimerów histonów H3-H4. Asf1 jest w stanie przekazać nowo zsyntetyzowany dimer H3-H4 do czynników osadzania za widełkami replikacyjnymi i ta aktywność sprawia, że dimery histonów H3-H4 są dostępne w miejscu odkładania histonów tuż po replikacji. Asf1 (i jego partner Rtt109) jest również zaangażowany w hamowanie ekspresji genów z replikowanych genów podczas fazy S.
Heterotrimeryczny chaperonowy czynnik składania chromatyny 1 ( CAF-1 ) jest białkiem tworzącym chromatynę, które bierze udział w odkładaniu histonów na obu nowo replikowanych niciach DNA w celu utworzenia chromatyny. CAF-1 zawiera motyw wiążący PCNA, zwany PIP-box, który umożliwia CAF-1 asocjację z replisomem poprzez PCNA i jest w stanie osadzać dimery histonów H3-H4 na nowo zsyntetyzowanym DNA. Chaperon Rtt106 jest również zaangażowany w ten proces i związany z dimerami CAF-1 i H3-H4 podczas tworzenia chromatyny. Procesy te ładują nowo zsyntetyzowane histony do DNA.
Po odłożeniu histonów H3-H4, nukleosomy tworzą się w wyniku asocjacji histonów H2A-H2B. Uważa się, że proces ten zachodzi poprzez kompleks FACT, ponieważ jest już związany z replisomem i jest w stanie wiązać wolny H2A-H2B lub istnieje możliwość innego białka opiekuńczego H2A-H2B, Nap1. Badania mikroskopii elektronowej pokazują, że dzieje się to bardzo szybko, ponieważ można zaobserwować, że nukleosomy tworzą zaledwie kilkaset par zasad za widełkami replikacyjnymi. Dlatego cały proces tworzenia nowych nukleosomów odbywa się tuż po replikacji w wyniku sprzężenia białek opiekuńczych histonów z replisomem.
Porównanie replikacji prokariotycznego i eukariotycznego DNA
W porównaniu z replikacją prokariotycznego DNA , ukończenie replikacji eukariotycznego DNA jest bardziej złożone i wymaga wielu miejsc startu replikacji i białek replikacyjnych. Prokariotyczny DNA jest ułożony w okrągły kształt i ma tylko jedno miejsce startu replikacji, gdy rozpoczyna się replikacja. Natomiast eukariotyczny DNA jest liniowy. Podczas replikacji istnieje aż tysiąc źródeł replikacji.
DNA eukariotyczne jest dwukierunkowe. Tutaj znaczenie słowa dwukierunkowy jest inne. Eukariotyczny liniowy DNA ma wiele początków (zwanych O) i zakończeń (zwanych T). „T” jest obecne na prawo od „O”. Jedno „O” i jedno „T” razem tworzą jeden replikon. Po utworzeniu kompleksu przedinicjacyjnego, gdy jeden replikon rozpoczyna elongację, inicjacja rozpoczyna się w drugim replikonie. Teraz, jeśli pierwszy replikon porusza się w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara, drugi replikon porusza się w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aż do osiągnięcia „T” pierwszego replikonu. W „T” oba replikony łączą się, aby zakończyć proces replikacji. Tymczasem drugi replikon również porusza się w kierunku do przodu, aby spotkać się z trzecim replikonem. Ten ruch dwóch replikonów zgodnie z ruchem wskazówek zegara i przeciwnie do ruchu wskazówek zegara jest określany jako replikacja dwukierunkowa.
Replikacja eukariotycznego DNA wymaga precyzyjnej koordynacji wszystkich polimeraz DNA i związanych z nimi białek w celu replikacji całego genomu za każdym razem, gdy komórka się dzieli. Proces ten osiąga się poprzez szereg etapów składania białek na początku replikacji, skupiając się głównie na regulacji replikacji DNA na asocjacji helikazy MCM z DNA. Te początki replikacji kierują liczbą kompleksów białkowych, które utworzą się w celu zainicjowania replikacji. W prokariotycznym DNA regulacja replikacji koncentruje się na wiązaniu białka inicjatora DnaA z DNA, przy czym inicjacja replikacji zachodzi wielokrotnie podczas jednego cyklu komórkowego. Zarówno prokariotyczny, jak i eukariotyczny DNA wykorzystują wiązanie ATP i hydrolizę do kierowania ładowaniem helikazy iw obu przypadkach helikaza jest ładowana w postaci nieaktywnej. Jednak eukariotyczne helikazy to podwójne heksamery, które są ładowane na dwuniciowy DNA, podczas gdy prokariotyczne helikazy to pojedyncze heksamery ładowane na jednoniciowy DNA.
Segregacja chromosomów to kolejna różnica między komórkami prokariotycznymi i eukariotycznymi. Szybko dzielące się komórki, takie jak bakterie, często zaczynają segregować chromosomy, które wciąż są w trakcie replikacji. W komórkach eukariotycznych segregacja chromosomów do komórek potomnych nie jest inicjowana, dopóki replikacja nie zostanie zakończona we wszystkich chromosomach. Jednak pomimo tych różnic, leżący u podstaw proces replikacji jest podobny zarówno dla prokariotycznego, jak i eukariotycznego DNA.
| Replikacja prokariotycznego DNA | Replikacja eukariotycznego DNA |
|---|---|
| Występuje wewnątrz cytoplazmy | Występuje wewnątrz jądra |
| Tylko jedno miejsce startu replikacji na cząsteczkę DNA | Mają wiele miejsc inicjacji replikacji w każdym chromosomie |
| Początek replikacji ma długość około 100-200 lub więcej nukleotydów | Każde miejsce startu replikacji składa się z około 150 nukleotydów |
| Replikacja zachodzi w jednym punkcie każdego chromosomu | Replikacja zachodzi w kilku punktach jednocześnie w każdym chromosomie |
| Mają tylko jedno źródło replikacji | Ma wiele źródeł replikacji |
| Inicjacja jest przeprowadzana przez białko DnaA i DnaB | Inicjacja jest przeprowadzana przez Kompleks Rozpoznawania Pochodzenia |
| Potrzebna jest topoizomeraza | Potrzebna jest topoizomeraza |
| Replikacja jest bardzo szybka | Replikacja jest bardzo powolna |
Lista białek replikacyjnych eukariotycznego DNA
Lista głównych białek zaangażowanych w replikację eukariotycznego DNA:
| Białko | Funkcja w replikacji eukariotycznego DNA |
|---|---|
| I 1 | Ładuje polimerazę DNA α na chromatynę wraz z kompleksem CMG na nici opóźnionej. Znany również jako Ctf4 w pączkujących drożdżach. |
| CDC45 | Wymagane do etapów inicjacji i wydłużania replikacji DNA. Część kompleksu helikazy Mcm2-7. Wymagane po etapie pre-RC do załadowania różnych białek do inicjacji i elongacji. |
| Kompleks Cdc45-Mcm-GINS (CMG). | Funkcjonalna helikaza DNA w komórkach eukariotycznych |
| Cdc6 | Wymagany do złożenia kompleksu Mcm2-7 w ORC, w połączeniu z Cdt1 . |
| Kinaza Cdc7-Dbf4 lub kinaza zależna od Dbf4 (DDK) | Kinaza białkowa wymagana do zainicjowania replikacji DNA, prawdopodobnie poprzez fosforylację białek podtrzymujących minichromosom. |
| Cdt1 | Ładuje kompleks Mcm2-7 na DNA w ORC na etapie poprzedzającym RC/licencjonowanie. Hamowany u metazoanów przez gemininę. |
| Zapięcie | Połącz syntezę nici wiodących z aktywnością złożonej helikazy CMG. Współpracuje z Mrc1 |
| Ctf4 | Ładuje polimerazę DNA α na chromatynę wraz z kompleksem CMG na nici opóźnionej. Homolog u metazoanów jest znany jako AND-1. |
| Kinaza cyklinozależna (CDK) | Cyklinozależna kinaza białkowa wymagana do zainicjowania replikacji i innych kolejnych etapów. |
| Dna2 | Endonukleaza klapowa 5' i helikaza zaangażowane w przetwarzanie fragmentów Okazaki. |
| Ligaza DNA I | Łączy fragmenty Okazaki podczas replikacji DNA. Aktywność ligazy jest również potrzebna do naprawy i rekombinacji DNA. |
| Polimeraza DNA α (Pol α) | Zawiera aktywność prymazy, która jest niezbędna do zainicjowania syntezy DNA zarówno na wiodącej, jak i opóźnionej nici. |
| Polimeraza DNA δ (Pol δ) | Wymagane do pełnej syntezy fragmentów Okazaki na nici opóźnionej, które zostały rozpoczęte przez polimerazę DNA α. |
| Polimeraza DNA ε (Pol ε) | Wiodąca polimeraza nici. Syntetyzuje DNA w widełkach replikacyjnych. Wiąże się wcześnie na początku przez Dbp11 i jest potrzebny do załadowania polimerazy DNA α. |
| dpb11 | Białko inicjujące replikację DNA. Ładuje polimerazę DNA ε na kompleksy przedreplikacyjne na początku. |
| Fen1 | Endonukleaza klapowa 5' zaangażowana w przetwarzanie fragmentów Okazaki. |
| Bliźnięta | Białko występujące w metazoanach i nieobecne w drożdżach. Wiąże się i dezaktywuje Cdt1, regulując w ten sposób tworzenie kompleksu przed replikacją / inicjacją. Zasugerowano również, aby promować tworzenie pre-RC przez wiązanie, a tym samym zapobieganie degradacji Cdt1 |
| GIN | Kompleks tetrameryczny składający się z Sld5, Psf1, Psf2, Psf3. Łączy się z kompleksem przedreplikacyjnym w czasie inicjacji i porusza się z widełkami replikacyjnymi podczas etapu elongacji. Wymagany do etapu elongacji replikacji DNA i być może wchodzi w skład kompleksu helikazy Mcm. |
| Białka podtrzymujące minichromosom (Mcm) | Sześć różnych białek z rodziny ATPaz AAA+, które tworzą heksamer w roztworze. Ten heksamer jest rekrutowany i ładowany przez ORC, Cdc6 i Cdt1 i tworzy podwójny heksamer, który jest topologicznie połączony wokół DNA, tworząc odporny na sól kompleks przedreplikacyjny. Podczas inicjacji replikacji Mcm2-7 oddala się od ORC widełkami replikacyjnymi. |
| Mcm10 | Wymagany do inicjacji i wydłużania etapów replikacji DNA. Zaangażowany w wiązanie chromatyny z Cdc45 i polimerazą DNA α. Wymagane również dla stabilności podjednostki katalitycznej polimerazy DNA α w pączkujących drożdżach S. cerevisiae . |
| Mrc1 | Połącz syntezę nici wiodących z aktywnością złożonej helikazy CMG. Homolog Metazoan jest znany jako Claspin. |
| Kompleks rozpoznawania pochodzenia (ORC) | Kompleks heteroheksameryczny złożony z białek Orc1 – Orc6. Wiąże się z DNA i składa kompleks Mcm2-7 na chromatynie razem z Cdc6 i Cdt1. |
| Antygen jądrowy proliferujących komórek (PCNA) | Białko trimeryczne o strukturze pierścienia, otacza DNA zapobiegając dysocjacji polimerazy DNA. Działa jako zacisk ślizgowy dla polimeraz δ i ε, poprawiając w ten sposób procesowość polimeraz replikacyjnych. |
| Współczynnik replikacji C (RFC) | Ładuje PCNA na przygotowane matryce i bierze udział w przełączaniu między polimerazą DNA a a polimerazami replikacyjnymi δ i ε. |
| Bariery widełek replikacyjnych (RFB) | Związany przez białka RFB w różnych miejscach w całym genomie. Są w stanie przerwać lub wstrzymać rozwidlenia replikacyjne, zatrzymując postęp replisomu. |
| Białko replikacyjne A (RPA) | Heterotrimeryczne jednoniciowe białko wiążące. Stabilizuje jednoniciowy DNA w widełkach replikacyjnych. |
| RNaza H | Rybonukleaza trawiąca RNA zhybrydyzowany z DNA. Zaangażowany w przetwarzanie fragmentów Okazaki. |
| Sld2 | Funkcje inicjujące replikację. Kluczowy substrat CDK, fosforylacja sprzyja interakcji z Dpb11. Wymagane do zainicjowania replikacji. |
| Sld3 | Funkcje inicjujące replikację. Kluczowy substrat CDK, fosforylacja sprzyja interakcji z Dpb11. Wymagane do zainicjowania replikacji. |
| Telomeraza | Rybonukleoproteina, która dodaje sekwencję DNA „TTAGGG”, powtarza się na końcu 3' nici DNA w telomerach. |
| Topoizomerazy | Reguluj nawijanie lub niedowijanie DNA |