Białko SR
Białka SR to konserwatywna rodzina białek zaangażowanych w składanie RNA . Białka SR zostały nazwane, ponieważ zawierają domenę białkową z długimi powtórzeniami reszt aminokwasowych seryny i argininy , których standardowe skróty to odpowiednio „S” i „R”. Białka SR mają długość około 200-600 aminokwasów i składają się z dwóch domen, motywu rozpoznawania RNA (RRM) i domena RS. Białka SR są częściej spotykane w jądrze niż w cytoplazmie, ale wiadomo, że kilka białek SR przemieszcza się między jądrem a cytoplazmą.
Białka SR odkryto w latach 90. XX wieku w Irlandii Północnej, Belfaście oraz w oocytach płazów, a później u ludzi. Ogólnie wydaje się, metazoany mają białka SR, a organizmy jednokomórkowe nie mają białek SR.
Białka SR są ważne w konstytutywnym i alternatywnym splicingu pre-mRNA, eksporcie mRNA, stabilizacji genomu, rozpadzie za pośrednictwem nonsensów i translacji. Białka SR alternatywnie składają pre-mRNA, preferencyjnie wybierając różne miejsca składania na niciach pre-mRNA, aby utworzyć wiele transkryptów mRNA z jednego transkryptu pre-mRNA. Po zakończeniu splicingu białko SR może pozostać przyłączone lub nie, aby pomóc w przeniesieniu nici mRNA z jądra. Ponieważ polimeraza RNA II dokonuje transkrypcji DNA na RNA, białka SR przyłączają się do nowo utworzonego pre-mRNA, aby zapobiec wiązaniu się pre-mRNA z kodującą nicią DNA w celu zwiększenia stabilizacji genomu. topoizomerazy I i SR również oddziałują w celu zwiększenia stabilizacji genomu. Białka SR mogą kontrolować stężenia określonego mRNA, który z powodzeniem ulega translacji do białka, wybierając kodony rozpadu, w których pośredniczy nonsens podczas alternatywnego splicingu. Białka SR mogą alternatywnie składać kodony NMD we własny transkrypt mRNA, aby automatycznie regulować stężenie białek SR. Poprzez szlak mTOR i interakcje z polirybosomami białka SR mogą zwiększać translację mRNA.
Ataksja teleangiektazja , nerwiakowłókniakowatość typu 1, kilka nowotworów, HIV-1 i rdzeniowy zanik mięśni zostały powiązane z alternatywnym splicingiem przez białka SR.
Historia
Białka SR odkryto niezależnie dzięki zastosowaniu dwóch różnych przeciwciał monoklonalnych . Pierwsze przeciwciało , mAb104, znalazło białka SR w jądrze oocytów płazów. Przeciwciało mAb104 wiąże się z fosfoepitopem na C-końcowej domenie białek SR. mAb104 wiąże się również z miejscami aktywnymi transkrypcji polimerazy RNA II. To przeciwciało umożliwiło identyfikację czterech białek SR ( SRp20 , SRp40 , SRp55 i SRp75 ) i wykazało ich zachowanie wśród kręgowców i bezkręgowców. Drugie przeciwciało, B52 zastosowano w Drosophila . B52 jest blisko spokrewniony z czynnikiem splicingowym SF2/ASF i wiąże się zarówno z RNA, jak i DNA u Drosophila . Odkrycie białek SR u Drosophila ujawniło trzy białka SR, SWAP (tłumik białej moreli), Tra i Tra-2 (odpowiednio transformator i transformator-2).
Przykłady genów
Poniżej znajduje się lista 14 ludzkich genów kodujących białka SR biorące udział w splicingu:
| Gen | Skróty | Białko | Umiejscowienie |
|---|---|---|---|
| SRSF1 | SFRS1; ASF; SF2; SF2p33; SFRS1; SRp30a | Bogaty w serynę/argininę czynnik splicingowy 1 | 17q22 |
| SRSF2 | SFRS2; PR264; SC-35; SC35; SFRS2; SFRS2A; SRp30b | Czynnik splicingowy bogaty w serynę/argininę 2 | 17q25 |
| SRSF3 | SFRS3; SRp20 | Czynnik splicingowy bogaty w serynę/argininę 3 | 6p21 |
| SRSF4 | SFR4; SRP75 | Czynnik splicingowy bogaty w serynę/argininę 4 | 1p35 |
| SRSF5 | HRS; SFR5; SRP40 | Czynnik splicingowy bogaty w serynę/argininę 5 | 14q24 |
| SRSF6 | B52; SFR6; SRP55 | Bogaty w serynę/argininę czynnik splicingowy 6 | 20q13 |
| SSRSF7 | 9G8; AAG3; SFR7 | Czynnik splicingowy bogaty w serynę/argininę 7 | 2p22 |
| SRSF8 | SFRS2B; SRp46 (tylko człowiek) | Czynnik splicingowy bogaty w serynę/argininę 8 | 11q21 |
| SRSF9 | SFRS9; SRp30c | Czynnik splicingowy bogaty w serynę/argininę 9 | 12q24 |
| SRSF10 | TASR1; SRp38; SRrp40; SFRS13A | Czynnik splicingowy bogaty w serynę/argininę 10 | 1p36.11 |
| SRSF11 | NET2; SFR11; dJ677H15.2; s54 | Bogaty w serynę/argininę czynnik splicingowy 11 | 1p31 |
| SRSF12 | SRrp35; SFRS13B | Bogaty w serynę/argininę czynnik splicingowy 12 | 6q15 |
| TRA2A | AWMS1; HSU53209 | Transformator 2 Alpha Homolog | 7p15.3 |
| TRA2B | PPP1R156; SFR10; SRFS10; TRAN2B | Homolog Transformer 2 Beta | 3q27.2 |
Struktura
Białka SR charakteryzują się domeną RS i co najmniej jednym motywem rozpoznawania RNA (RRM). RRM zwykle znajduje się w pobliżu N-końca . Domena RS znajduje się w pobliżu C-końca koniec białka SR. Domeny RS regulują interakcje białko-białko białek SR. Na podstawie analizy sekwencji podejrzewa się, że białka SR są wewnętrznie nieuporządkowanymi białkami, w wyniku czego powstaje nieustrukturyzowana domena RS. Osiem niefosforylowanych powtórzeń argininy i seryny w domenie RS przybiera kształt spiralny z argininą na zewnątrz w celu zmniejszenia ładunku, aw stanie ufosforylowanym osiem powtórzeń argininy i seryny tworzy kształt „pazura”.
Białka SR mogą mieć więcej niż jedną domenę RRM. Druga domena RRM nazywana jest motywu rozpoznawania RNA (RRMH). Domeny RRM znajdują się w pobliżu N-końca białek SR. Domena RRM pośredniczy w interakcjach RNA białek SR poprzez wiązanie się z sekwencjami wzmacniacza splicingu egzonu. RRMH zwykle ma słabsze interakcje z RNA w porównaniu z domeną RRM. Z NMR domena RRM SRSF1, białka SR, ma fałdowaną strukturę wiążącą RNA. Domena RRM może również chronić fosforylowaną domenę RS, co sugeruje, że domena RS pasuje do domeny RRM.
Lokalizacja i translokacja
Białka SR można znaleźć zarówno w cytozolu , jak iw plamkach jądrowych w jądrze . Białka SR występują głównie w jądrze. Lokalizacja zależy od fosforylacji domeny RS białka SR. Fosforylacja domeny RS powoduje, że białka SR wchodzą i pozostają w jądrze. Częściowa defosforylacja domeny RS powoduje, że białka SR opuszczają jądro, a białka SR z niefosforylowanymi domenami RS znajdują się w cytosolu.
Białka SR znajdują się w dwóch różnych typach plamek jądrowych, skupiskach granulek międzychromatynowych i włókienkach perichromatynowych . Skupiska granulek międzychromatynowych służą do przechowywania i ponownego składania białek splicingowych pre-mRNA. Włókienka perichromatyny to obszary transkrypcji genów, w których białka SR łączą się z polimerazą RNA II w celu kotranskrypcyjnego splicingu.
kinazy białkowe odgrywają rolę w lokalizacji białek SR w jądrze. Kinaza białkowa SR 1 (SRPK1) wiąże się i fosforyluje 10-12 reszt serynowych na N-końcowej części domeny RS białek SR znajdujących się w cytosolu. Białka SR mogą przemieszczać się do jądra po ufosforylowaniu seryny. Fosforylowane białko SR przemieszcza się do jądra i przenosi się do plamki jądrowej. Druga kinaza białkowa, CLK1, następnie fosforyluje pozostałe seryny w domenie RS białka SR, powodując ich translokację z plamki jądrowej i asocjację z polimerazą RNA II w celu współtranskrypcyjnego splicingu RNA.
Ruch białek SR z jądra jest kontrolowany przez inny mechanizm. Białka SR, które nie opuszczają jądra, nazywane są niewahającymi się białkami SR, a te, które opuszczają jądro, nazywane są wahadłowymi białkami SR. SRp20 ( SFRS3 ) i 9G8 ( SFRS7 ) to dwa przykłady transportujących białek SR ssaków. Oba rozpoznają i wiążą poli-A RNA w celu transportu RNA. Większość białek SR, które nie opuszczają jądra z transkryptem RNA, ma sygnały retencji jądrowej. Przemieszczające się białka SR łączą się z jądrowym czynnikiem eksportu TAP w celu eksportu z jądra. Metylacja reszt argininy w RRM może również przyczynić się do eksportu białek SR poza jądro.
Funkcjonować
Wykazano, że białka SR odgrywają rolę w splicingu alternatywnym i konstytutywnym, co skutkuje zróżnicowaną ekspresją genów, a także odgrywają rolę w eksporcie mRNA, stabilizacji genomu, rozpadzie bezsensownym i translacji .
Łączenie
Pierwszym krokiem dla białek SR, aby rozpocząć alternatywny splicing transkryptu RNA, jest związanie białek SR z domeną końca karboksylowego (CTD) największej podjednostki polimerazy RNA II. CTD składa się z konserwatywnej powtarzającej się sekwencji heptapeptydowej YSPTSPS. Różne etapy transkrypcji mają różne poziomy fosforylacji CTD polimerazy RNA II. Przed rozpoczęciem transkrypcji CTD ma niski poziom fosforylacji, ale następnie ulega hiperfosforylacji podczas inicjacji i wydłużania. Domena RS białek SR oddziałuje z hiperfosforylowanym CTD podczas wydłużania transkrypcji.
Polimeraza RNA II przechodzi od inicjacji do wydłużania, gdy kinaza P-TEFb fosforyluje Ser5 i Ser2 na polimerazie RNA II . Białka SR oddziałują z CDK9 , składnikiem kinazy P-TEFb, prowadząc do fosforylacji Ser2. Białka SR wiążą się z fosforylowanym Ser2 na CTD. Umiejscowienie białek SR na polimerazie RNA II pozwala białkom SR najpierw „zobaczyć” nowy transkrypt RNA. Białka SR następnie przemieszczają się z polimerazy RNA II do transkryptu pre-mRNA.
Na nowym transkrypcie RNA białka SR mogą następnie stymulować tworzenie spliceosomu . Białka SR promują wiązanie U1 snRNP i U2AF snRNP z nowym transkryptem RNA, aby rozpocząć tworzenie spliceosomu. Białka SR pomagają również U2 rozpoznać i związać się z miejscem rozgałęzienia intronu , który ma zostać wycięty. Później w tworzeniu spliceosomu białka SR pomagają rekrutować snRNP U4 / U6 i U5 .
Białka SR są ważne dla wyboru miejsc splicingowych dla alternatywnego splicingu. Białka SR rozpoznają wzmacniacze i wyciszacze intronów i eksonów. Białka SR łączą się z białkami podobnymi do SR, aby wybrać wzmacniacze splicingu eksonów na transkryptach RNA, powodując wiązanie U2 snRNP z górnym, sąsiednim miejscem rozgałęzienia, powodując składanie spliceosomu w określonym miejscu 3 'wybranym przez białka SR.
Aktywności promujące alternatywne splicing białek SR są w przeciwieństwie do aktywności hnRNP . hnRNP wiążą się z wyciszaczami splicingu eksonów , ESS i hamują włączenie egzonów, dlatego hnRNP są represorami splicingu. Białka SR i hnRNP konkurują o wiązanie z sekwencjami ESE i ESS w eksonach. Wiązanie opiera się na stężeniach białek SR i hnRNP w komórkach. Jeśli komórka ma wysokie stężenie białek SR, jest bardziej prawdopodobne, że białka SR będą wiązać się z ESE w porównaniu z hnRNP wiążącymi się z ESS. Jeśli komórka ma wysokie stężenie hnRNP, wówczas hnRNP mogą konkurować z białkami SR o ESS w porównaniu z ESE.
Białka SR mogą działać antagonistycznie, konkurując ze sobą o wiązanie egzonowych wzmacniaczy splicingu . Niektóre dowody sugerują, że wybór wariantu splicingu mRNA zależy od względnych stosunków białek SR. Białka SR wydają się zbędne. Eksperymenty wykazały, że wybijanie białek SR za pomocą RNAi nie wykazuje wykrywalnego fenotypu u C. elegans . Po znokautowaniu jednego określonego białka SR inne inne białko SR może nadrobić utraconą funkcję białka SR, które zostało znokautowane. Specyficzne aktywności białek SR są ważne dla określonych tkanek i stadiów rozwojowych.
Role zależne od eksonu
Białka SR wybierają alternatywne miejsca splicingowe 3' w górę poprzez rekrutację U2AF 35 i U2AF 65 do specyficznych sekwencji pirymidynowych ESE w eksonie transkryptu pre-mRNA.
Białka SR mogą również alternatywnie wybierać różne miejsca splicingowe 5' w dół, wiążąc się z ESE powyżej miejsca splicingowego. Podejrzewany mechanizm polega na tym, że alternatywne miejsca splicingowe 5' są wybierane, gdy białka SR wiążą się z górnym ESE i oddziałują z U1-70K i razem rekrutują U1 do miejsca splicingowego 5'.
W splicingu konstytutywnym białka SR wiążą się z U2AF i U1-70K, aby wypełnić lukę między dwoma składnikami spliceosomu, aby zaznaczyć miejsca splicingowe 3 'i 5'. Konstytutywnie złożone eksony mają wiele różnych sekwencji wiążących białka SR, które działają jako konstytutywne wzmacniacze splicingu. Różnica między składaniem alternatywnym a konstytutywnym polega na tym, że podczas składania alternatywnego wybór miejsca składania jest regulowany.
Role niezależne od eksonu
Niezależne od eksonów role białek SR nazywane są niezależnymi od eksonów, ponieważ nie wiadomo, czy białka SR muszą wiązać się z eksonami, aby mogły wykonywać niezależne od eksonów czynności. Białka SR mogą wiązać się z U1 i U2AF, podczas gdy są one jednocześnie związane z miejscami składania 3' i 5' bez wiązania się z transkryptem pre-mRNA. Białko SR tworzy w ten sposób most w poprzek intronu w tak zwanej interakcji między intronami. Białka SR również rekrutują cząsteczkę tri-snRNP U4/U6·U5 do dojrzewającego kompleksu spliceosomu poprzez interakcję z domenami RS w tri-snRNP. Białka SR mogą być w stanie wiązać się bezpośrednio z miejscem składania 5' i rekrutować kompleks U1 spliceosomu.
eksport mRNA
Białka SR mogą być wahadłowymi białkami SR lub nieprzesuwającymi się białkami SR. Niektóre białka SR łączą się z czynnikiem eksportu RNA TAP, jądrowym czynnikiem eksportu, aby wyprowadzić RNA z jądra. Właściwość wahadłowa białka SR jest określona przez status fosforylacji domeny RS. Po hiperfosforylacji białka SR wiążą się z transkryptami pre-mRNA, ale białka SR ulegają częściowej defosforylacji podczas transkrypcji, umożliwiając im interakcję z NXF1 . Tak więc fosforylacja domeny RS określa, czy białka SR pozostają z transkryptem RNA po splicingu ko-transkrypcji i podczas dojrzewania mRNP. Jeśli domena RS pozostaje ufosforylowana, białko SR nie będzie przemieszczać się z jądra do cytozolu. Fosforylowane białko SR zostanie oddzielone od transkryptu mRNA, dodatkowo zapobiegając przemieszczaniu się fosforylowanych białek SR. Jeśli domena RS ulegnie częściowej defosforylacji, wówczas białko SR będzie przemieszczać się z jądra do cytozolu. Metylacja i ładunek reszt argininy w domenie RRM również przyczynia się do eksportu białek SR związanych z mRNA.
Stabilizacja genomu
Białka SR mogą zwiększać stabilność genomu, zapobiegając tworzeniu się pętli R w nici DNA , która jest aktywnie transkrybowana podczas transkrypcji. Białko SR SC35 ma zdolność wiązania się z największą podjednostką polimerazy RNA II w fosforylowanej domenie C-końcowej . Gdy polimeraza RNA II zacznie wytwarzać nową nić RNA, białka SR przemieszczają się z domeny C-końcowej polimerazy RNA II do nowej nici RNA. Ruch białek SR z polimerazy RNA II do nowej nici RNA uniemożliwia nowej nici RNA, która jest komplementarna do nici matrycy DNA, wiązanie się z nicią matrycy DNA, zapobiegając powstawaniu pętli R.
mogą również stabilizować DNA podczas transkrypcji poprzez interakcję z topoizomerazą I. Kiedy topoizomeraza I, Topo I, zmniejsza superskręcenie spowodowane transkrypcją, gdy jest związana z DNA. Kiedy Topo I nie jest związane z DNA, może fosforylować białko SR SF2/ASF. Topo I i SF2/ASF oddziałują, gdy SF2/ASF jest hipofosforylowany podczas wydłużania transkrypcji. Białka SR mogą ulec hipofosforylacji podczas wydłużania, zmniejszając ich powinowactwo do polimerazy RNA II, powodując przejście białek SR do Topo I. Kiedy Topo I tworzy kompleksy z SF2 / ASF, nie może już cofnąć superskręcenia DNA, powodując zatrzymanie wydłużania. Topo I fosforyluje S2F/ASF, zwiększając powinowactwo białek SR do RNA poli II, przesuwając S2F/ASF z Topo I z powrotem do RNA poli II, umożliwiając kontynuację wydłużania.
Rozpad za pośrednictwem nonsensów
Białka SR mogą alternatywnie składać transkrypty pre-mRNA, aby uwzględnić rozpad, w którym pośredniczy nonsens (NMD) kodonów w mRNA. Najczęstszą metodą odpowiedzi NMD w komórkach jest alternatywny splicing. Jeśli transkrypt pre-mRNA ma zduplikowane miejsce splicingowe 5' i białka SR są nadeksprymowane, wówczas NMD można zwiększyć. Wariant splicingowy z kodonem NMD jest wybierany częściej podczas składania, a komórka jest bardziej wrażliwa na NMD w dalszej części translacji. Szacuje się, że blisko 30% mRNA z alternatywnego składania ulega degradacji przez NMD. Stężenia białka SR w komórkach mogą być autoregulowane przez kodony NMD w pre-mRNA białek SR. Na przykład, białko SC35 SR może alternatywnie składać pre-mRNA SC35, aby zawierało kodon NMD w mRNA. Lokalizacja wiązania białka SR na nici pre-mRNA oraz to, które białka SR wiążą, determinują aktywność NMD komórki.
Tłumaczenie
Białka SR mogą pośrednio i bezpośrednio wpływać na translację. Białka SR SF2/ASF alternatywnie składają transkrypt MNK2. MNK2 jest kinazą inicjującą translację. Wysokie poziomy SF2/ASF wytwarzają izoformę MNK2, która zwiększa translację zależną od czapeczki poprzez promowanie fosforylacji eIF4E niezależnego od MAPK . SF2/ASF rekrutuje składniki szlaku mTOR , w szczególności S6K1 . SF2/ASF tworzy onkogenną postać S6K1 w celu zwiększenia częstości występowania translacji zależnej od czapeczki. SF2/ASF może również wchodzić w interakcje z polirybosomami, bezpośrednio wpływając na translację mRNA na białko poprzez rekrutację składnika szlaku mTOR . SF2/ASF zwiększa fosforylację rpS6 i eIF4B przez S6K1. 9G8 zwiększa translację niesplicowanego mRNA z konstytutywną sekwencją transportową.
Choroby
Różnorodność genetyczna zwiększa się dzięki alternatywnym splicingom białek SR, ale splicing może również skutkować mutacjami w niciach mRNA. Mutacje w pre-mRNA mogą wpływać na prawidłowy wybór miejsca splicingowego dla białek SR. Mutacje w mRNA, z powodu nonsensownego zmienionego splicingu przez białka SR, zostały powiązane z ataksją teleangiektazją , nerwiakowłókniakowatością typu 1 , kilkoma nowotworami , HIV -1 i rdzeniowym zanikiem mięśni .
Rak
Kilka białek SR jest zaangażowanych w raka. Podwyższone poziomy SF2/ASF, SC35 i SRp20 są związane z rozwojem raka piersi i jajnika. SF2/ASF jest również regulowany w górę w nowotworach płuc, nerek i wątroby. SFRS1, gen kodujący SF2/ASF, jest znanym protoonkogenem . Mutacje w sekwencji ESE BRCA1 zostały powiązane z nieregularnym pomijaniem eksonów, ponieważ SF2/ASF nie może rozpoznać ESE.
HIV
Trzy białka SR są zaangażowane w HIV-1 , SRp75, SF2/ASF i SRp40. Wszystkie trzy białka SR są ważne dla alternatywnego składania wirusowego pre-mRNA. HIV może również zmieniać stężenia określonych białek SR w komórce. Nowe metody leczenia zakażeń wirusem HIV mają na celu ukierunkowanie na określone białka SR, aby zapobiec replikacji wirusa w komórkach. Jedna terapia działa poprzez blokowanie białkom SR wyboru miejsc splicingowych 3' dla ważnego białka regulatorowego HIV-1.
Rdzeniowy zanik mięśni
Zanik mięśni kręgosłupa jest spowodowany przejściem z cytozyny do tyminy . Mutacja przejściowa powoduje pominięcie eksonu 7 podczas splicingu. Egzon można pominąć z dwóch powodów. Po pierwsze, mutacja uniemożliwia SF2/ASF rozpoznanie prawidłowego ESE. Po drugie, mutacja tworzy ESS dla hnRNP do wiązania i blokowania składania eksonu.