Indukowane zatrzymanie cyklu komórkowego
Indukowane zatrzymanie cyklu komórkowego to zastosowanie chemicznej lub genetycznej manipulacji w celu sztucznego zatrzymania postępu w cyklu komórkowym . Procesy komórkowe, takie jak duplikacja genomu i podział komórek, zatrzymują się. Może to być tymczasowe lub stałe. Jest to sztuczna aktywacja naturalnie występujących punktów kontrolnych cyklu komórkowego , wywołana przez egzogenne bodźce kontrolowane przez eksperymentatora.
Organizmy modelowe
W kontekście badań akademickich zatrzymanie cyklu komórkowego jest zwykle przeprowadzane w organizmach modelowych i ekstraktach komórkowych, takich jak Saccharomyces cervisiae (drożdże) lub oocyty Xenopus (żabie jaja). Ekstrakty z żabich komórek jajowych były szeroko stosowane w badaniach cyklu komórkowego, ponieważ są stosunkowo duże, osiągając średnicę 1 mm, a więc zawierają duże ilości białka, co ułatwia pomiar poziomu białka.
Cele
Istnieje wiele powodów, dla których badacz może chcieć tymczasowo lub na stałe uniemożliwić postęp w cyklu komórkowym.
Synchronizacja cyklu komórkowego
W niektórych eksperymentach badacz może chcieć kontrolować i synchronizować czas, w którym grupa komórek przechodzi do następnej fazy cyklu komórkowego. Komórki można indukować do zatrzymania, gdy docierają (w różnych punktach czasowych) do określonej fazy, tak aby po zniesieniu zatrzymania (na przykład ratowanie postępu cyklu komórkowego przez wprowadzenie innej substancji chemicznej) wszystkie komórki wznowiły postęp cyklu komórkowego w w tym samym czasie. Oprócz tego, że ta metoda działa jako naukowa kontrola , kiedy komórki wznawiają cykl komórkowy, można ją wykorzystać do zbadania konieczności i wystarczalności .
Innym powodem, dla którego ważna jest synchronizacja, jest kontrola zawartości DNA, która zmienia się w różnych częściach cyklu komórkowego w zależności od tego, czy replikacja DNA nastąpiła od ostatniej rundy zakończonej mitozy i cytokinezy.
Ponadto synchronizacja dużej liczby komórek w tej samej fazie pozwala na zebranie wystarczająco dużych grup komórek w tym samym cyklu do wykorzystania w innych testach, takich jak western blot i sekwencjonowanie RNA .
Naprawa uszkodzeń DNA
Naukowcy mogą badać mechanizmy naprawy uszkodzeń DNA . Biorąc pod uwagę, że niektóre z poniższych mechanizmów indukowania zatrzymania cyklu komórkowego obejmują uszkodzenie DNA, umożliwia to zbadanie, w jaki sposób komórka reaguje na uszkodzenie jej materiału genetycznego.
Identyfikacja funkcji białek in vivo
Inżynieria genetyczna komórek z określonymi nokautami genów może również skutkować zatrzymaniem komórek w różnych fazach cyklu komórkowego. Przykłady obejmują:
- G1 : Drożdże Saccharomyces cerevisiae eksprymujące dominujące zmutowane allele zatrzymania CDC28 w G1 , co wskazuje , że CDC28 jest niezbędny do przejścia poza fazę G1 .
- S: Schizosaccharomyces pombe (drożdże rozszczepialne) wykazujące ekspresję wrażliwej na temperaturę zmutowanej postaci zatrzymania polimerazy DNA delta (pol delta ts03) w fazie S.
- G2 : Drożdże rozszczepialne wykazujące ekspresję niektórych zmutowanych form CDC2 niezdolnych do zatrzymania w G2 w odpowiedzi na uszkodzenie DNA, co wskazuje, że produkt genu bierze udział w zatrzymaniu G2 .
- M: Zmutowany ekran pączkujących drożdży z zatrzymaniem mitozy zidentyfikował CDC16 , CDC23 i CDC27 jako kluczowe geny, które po zmutowaniu powodują zatrzymanie mitozy.
Zatrzymanie fazy G 1
Faza G1 częścią jest pierwszą z czterech faz cyklu komórkowego i jest interfazy . W G 1 komórka syntetyzuje informacyjne RNA (mRNA) i białka przygotowując się do kolejnych etapów interfazy prowadzącej do mitozy. W ludzkich komórkach somatycznych cykl komórkowy trwa około 18 godzin, a faza G1 stanowi około 1/3 tego czasu . Z drugiej strony, w embrionach żab, jeżowców i muszek owocówek G 1 faza jest niezwykle krótka i zamiast tego występuje niewielka przerwa między cytokinezą a fazą S.
Czynnik Alfa
Czynnik α to feromon wydzielany przez Saccharomyces cervisiae , który zatrzymuje komórki drożdży w fazie G 1 . Czyni to poprzez hamowanie enzymu cyklazy adenylanowej . Enzym katalizuje konwersję trifosforanu adenozyny (ATP) do 3',5'-cyklicznego AMP (cAMP) i pirofosforanu .
Hamowanie kontaktu
Inhibicja kontaktowa to metoda zatrzymania komórek, gdy sąsiednie komórki stykają się ze sobą. Powoduje to powstanie pojedynczej warstwy zatrzymanych komórek zatrzymanych komórek i jest to proces, którego szczególnie brakuje w komórkach nowotworowych . Podejrzewany mechanizm jest zależny od p27 Kip1 , cyklinozależnego inhibitora kinazy . Poziomy białka p27 Kip1 są podwyższone w komórkach zatrzymujących. Ten naturalny proces można naśladować w laboratorium poprzez nadekspresję p27 Kip1 , co powoduje indukowane zatrzymanie cyklu komórkowego w G1 faza.
Mimozyna
Mimozyna jest aminokwasem roślinnym , który, jak wykazano, odwracalnie hamuje progresję poza fazę G1 w niektórych komórkach ludzkich, w tym w komórkach limfoblastoidalnych . Proponowany mechanizm działania to chelator żelazo/cynk , który wyczerpuje żelazo w komórce. To indukuje pęknięcia dwuniciowe w DNA, hamując replikację DNA. Może to obejmować blokowanie działania zależnej od żelaza reduktazy rybonukleotydowej . Może również hamować transkrypcję hydroksymetylotransferazy serynowej , która jest zależna od cynku.
Pozbawienie serum
W hodowli komórkowej surowica jest pożywką wzrostową , w której komórki rosną i zawiera niezbędne składniki odżywcze. Wykazano, że zastosowanie pozbawienia surowicy – częściowego lub całkowitego usunięcia surowicy i jej składników odżywczych – zatrzymuje i synchronizuje progresję cyklu komórkowego w fazie G 0 , na przykład w noworodkowych astrocytach ssaków i fibroblastach napletka ludzkiego .
Głodzenie aminokwasów to podobne podejście. Podczas wzrostu na pożywce bez niektórych niezbędnych aminokwasów, takich jak metionina , niektóre komórki zatrzymują się we wczesnej fazie G1 .
zatrzymanie fazy S
Faza S następuje po fazie G1 poprzez przejście i G1 /S i poprzedza fazę G2 w interfazie jest częścią cyklu komórkowego, w której DNA jest replikowane. Ponieważ dokładna duplikacja genomu ma kluczowe znaczenie dla pomyślnego podziału komórki, procesy zachodzące w fazie S są ściśle regulowane i szeroko konserwowane. Kompleksy przedreplikacyjne złożone przed fazą S są przekształcane w aktywne widełki replikacyjne . Napędem tej konwersji są kinazy cyklinozależne od Cdc7 i fazy S , które są regulowane w górę po przejściu G 1 / S.
Afidikolina
Aphidicolin to antybiotyk wyizolowany z grzyba Cephalosporum aphidicola . Jest odwracalnym inhibitorem replikacji eukariotycznego jądrowego DNA , który blokuje przejście poza fazę S. Jej mechanizm polega na hamowaniu DNA A i D. Badanie strukturalne wykazało, że uważa się, że dzieje się to poprzez wiązanie miejsca aktywnego alfa polimerazy i „obracanie matrycy guaniny”, co zapobiega wiązaniu trifosforanu dezoksycytydyny (dCTP) . Ten blok fazy S indukuje apoptozę w komórkach HeLa .
hydroksymocznik
Hydroksymocznik (HU) to lek drobnocząsteczkowy , który hamuje enzym reduktazę rybonukleotydową (RNR), zapobiegając katalizie przekształcania dezoksyrybonukleotydów (DNT) w rybonukleotydy . Przypuszcza się, że w RNR występuje wolny rodnik tyrozylowy , który jest wyłączany przez HU. Wolne rodniki są niezbędne do redukcji DNT i zamiast tego są usuwane przez HU. Wykazano, że HU zatrzymuje komórki zarówno w fazie S (komórki zdrowe), jak i bezpośrednio przed cytokinezą (komórki zmutowane).
2,3-DCPE
2[[3-(2,3-dichlorofenoksy)propylo]amino]etanol (2,3-DCPE) jest małą cząsteczką , która indukuje zatrzymanie fazy S. Zostało to wykazane w liniach komórek nowotworowych i zmniejsza ekspresję bardzo dużego chłoniaka B-komórkowego ( Bcl-XL ), białka antyapoptotycznego, które zapobiega uwalnianiu zawartości mitochondriów, takiej jak cytochrom c .
Zatrzymanie fazy G 2
Faza G 2 jest końcową częścią interfazy i bezpośrednio poprzedza mitozę. Zostanie wprowadzony do zwykłych komórek tylko wtedy, gdy replikacja DNA w fazie S zakończy się pomyślnie. Jest to okres szybkiego wzrostu komórek i syntezy białek, podczas którego komórka przygotowuje się do mitozy.
Zniszczenie mRNA cykliny
Cykliny to białka, które kontrolują postęp w cyklu komórkowym poprzez aktywację kinaz zależnych od cyklin. Zniszczenie endogennego informacyjnego RNA cykliny w komórce może zatrzymać ekstrakty jaj żaby w interfazie i uniemożliwić im wejście w mitozę. Wprowadzenie egzogennego mRNA cykliny jest również wystarczające do uratowania progresji cyklu komórkowego. Jedną z metod tego zniszczenia jest użycie antysensownych oligonukleotydów , fragmenty RNA, które wiążą się z mRNA cykliny i zapobiegają translacji mRNA na białko cykliny. W rzeczywistości można to wykorzystać do zniszczenia cyklin specyficznych dla fazy poza G2 - na przykład zniszczenie mRNA cykliny D1 przez antysensowne oligonukleotydy zapobiega progresji z fazy G1 do fazy S.
Zatrzymanie mitozy
Mitoza jest ostatnią częścią cyklu komórkowego i następuje po interfazie. Składa się z czterech faz - profazy , metafazy , anafazy i telofazy - i obejmuje kondensację chromosomów w jądrze , rozpuszczenie otoczki jądrowej i oddzielenie siostrzanych chromatyd przez włókna wrzeciona . Po zakończeniu mitozy włókna wrzeciona zanikają, a błona jądrowa odnawia się wokół każdego z dwóch zestawów chromosomów. Po udanej mitozie komórka fizycznie dzieli się na dwie identyczne komórki potomne w procesie zwanym cytokinezą , co kończy pełną rundę cyklu komórkowego. Każda z tych nowych komórek mogłaby wtedy potencjalnie ponownie wejść w fazę G1 i ponownie rozpocząć cykl komórkowy.
Nokodazol
Nokodazol jest środkiem chemicznym, który zakłóca polimeryzację mikrotubul. Komórki potraktowane nocodazolem zatrzymują zawartość DNA fazy G2 lub M, co można zweryfikować za pomocą cytometrii przepływowej. Na podstawie mikroskopii ustalono, że wchodzą w mitozę, ale nie mogą tworzyć wrzecion niezbędnych do metafazy, ponieważ mikrotubule nie mogą polimeryzować. Badania nad mechanizmem wskazały, że potencjalnie zapobiega on tworzeniu się heterodimeru alfa/beta przez tubulinę.
taksol
Taksol działa odwrotnie niż nocodazol, zamiast tego stabilizuje polimer mikrotubuli i zapobiega jego rozpadowi. Powoduje to również zatrzymanie fazy M, ponieważ wrzeciono, które ma rozrywać siostrzane chromatydy, nie może się rozłożyć. Działa poprzez specyficzne miejsce wiązania na polimerze mikrotubuli i jako taki nie wymaga GTP ani innych kofaktorów do indukowania polimeryzacji tubuliny.
Temperatura
Wykazano, że temperatura reguluje postęp cyklu komórkowego HeLa. Stwierdzono, że mitoza jest najbardziej wrażliwą na temperaturę częścią cyklu komórkowego. Zatrzymanie mitozy przed cytokinezą było widoczne poprzez akumulację komórek w mitozie w temperaturach poniżej normalnej między 24 a 31 ° C (75,2-87,8 ° F).
Weryfikacja
Istnieje kilka metod, które można wykorzystać do sprawdzenia, czy komórki zostały zatrzymane we właściwej fazie.
Cytometrii przepływowej
Cytometria przepływowa to technika pomiaru właściwości fizycznych i chemicznych populacji komórek za pomocą laserów i barwników fluoroforowych kowalencyjnie związanych z markerami białkowymi. Im silniejszy sygnał, tym więcej danego białka jest obecne. Barwienie DNA barwnikami jodku propidyny lub 4',6'-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI) umożliwia wyznaczenie lub sortowanie komórek pomiędzy fazami G1, S lub G2 / M.
Immunoblotting
Immunoblotting to wykrywanie określonych białek w próbce tkanki lub ekstrakcie. Pierwotne przeciwciała rozpoznają i wiążą dane białko, a drugorzędowe przeciwciała są dodawane, które rozpoznają pierwszorzędowe przeciwciała. Drugorzędowe przeciwciało jest następnie wizualizowane poprzez barwienie lub immunofluorescencję , umożliwiając pośrednie wykrycie pierwotnego białka docelowego.
Immunoblotting można przeprowadzić w celu wykrycia obecności cyklin , białek regulujących cykl komórkowy. Różne klasy cyklin są regulowane w górę iw dół w różnych częściach cyklu komórkowego. przykład G1 /S pik białka cykliny E wskazywałby na przejście , pik cykliny A wskazywałby na późną fazę G2, a pik cykliny B wskazywałby na mitozę.
Wskazanie cyklu komórkowego oparte na ubikwitynacji fluorescencji (FUCCI)
FUCCI to system, który wykorzystuje specyficzną dla cyklu komórkowego ekspresję białek i ich degradację na szlaku ubikwityna-proteasom . Dwie sondy fluorescencyjne – Cdt1 i Geminina skoniugowane z białkami fluorescencyjnymi – umożliwiają wizualizację w czasie rzeczywistym fazy cyklu komórkowego, w której znajduje się komórka.