c-Raf

„RAF1” przekierowuje tutaj. Informacje na temat silnika samolotu można znaleźć w RAF 1 .
RAF1
Protein RAF1 PDB 1c1y.png
Dostępne konstrukcje
WPB Wyszukiwanie ortologów:
Identyfikatory
, protoonkogen Raf-1, kinaza serynowo-treoninowa, CMD1NN, CRAF, NS5, Raf-1, c-Raf
Identyfikatory zewnętrzne
ortologi
Gatunek Człowiek Mysz
Entrez
Ensembl
UniProt
RefSeq (mRNA)

RefSeq (białko)

Lokalizacja (UCSC)
PubMed search
Wikidane
Wyświetl/edytuj człowieka Wyświetl/edytuj mysz

Protoonkogen kinazy serynowo-treoninowej RAF, znany również jako protoonkogen c-RAF lub po prostu c-Raf lub nawet Raf-1, jest enzymem , który u ludzi jest kodowany przez gen RAF1 . Białko c-Raf jest częścią szlaku ERK1/2 jako kinaza MAP (MAP3K), która działa poniżej podrodziny Ras związanych z błoną GTPaz. C-Raf jest członkiem rodziny kinaz Raf , specyficznych dla serynowo/treoninowych kinaz białkowych , z grupy kinaz TKL (podobnych do kinazy tyrozynowej).

Odkrycie

Pierwszy gen Raf, v-Raf, został znaleziony w 1983 roku. Wyizolowano go z mysiego retrowirusa noszącego numer 3611. Wkrótce wykazano, że jest zdolny do przekształcania fibroblastów gryzoni w nowotworowe linie komórkowe , więc gen ten otrzymał nazwę Virus- wywołany szybko przyspieszonym włókniakomięsakiem (V-RAF). Rok później w ptasim retrowirusie MH2 znaleziono inny gen transformujący, nazwany v-Mil – który okazał się bardzo podobny do v-Raf. Naukowcom udało się wykazać, że te geny kodują enzymy wykazujące aktywność kinazy serynowo-treoninowej. Normalne komórkowe homologi v-Raf i v-Mil zostały wkrótce znalezione zarówno w genomie myszy, jak i kurczaka (stąd nazwa c-Raf dla normalnego komórkowego genu Raf) i stało się jasne, że one również odgrywają rolę w regulacji wzrostu i podział komórek.

c-Raf jest głównym składnikiem szlaku kinazy białkowej aktywowanej mitogenami (MAPK): sygnalizacja ERK1/2 . Pełni funkcję kinazy MAP3, inicjując całą kaskadę kinaz. Kolejne eksperymenty wykazały, że normalne, komórkowe geny Raf mogą również mutować, stając się onkogenami, poprzez „przesterowanie” aktywności MEK1/2 i ERK1/2. W rzeczywistości genomy kręgowców zawierają wiele genów Raf. Kilka lat później po odkryciu c-Raf opisano dwie dalsze spokrewnione kinazy: A-Raf i B-Raf . Te ostatnie stały się przedmiotem badań w ostatnich latach, ponieważ duża część ludzkich nowotworów jest nosicielami onkogennych mutacji „sterujących” w genie B-Raf. Mutacje te indukują niekontrolowaną, wysoką aktywność enzymów Raf. Tym samym diagnostyczne i terapeutyczne zainteresowanie kinazami Raf osiągnęło w ostatnich latach nowy szczyt.

Struktura

Ludzki gen c-Raf znajduje się na chromosomie 3 . Opisano co najmniej dwie izoformy mRNA (wynikające z włączenia lub usunięcia alternatywnego eksonu ), które wykazują jedynie niewielkie różnice. Krótsza, główna izoforma - składająca się z 17 eksonów - koduje kinazę białkową złożoną z 648 aminokwasów.

Schematyczna architektura ludzkiego białka c-Raf

Podobnie jak wiele innych MAPKKK , c-Raf jest białkiem wielodomenowym , z kilkoma dodatkowymi domenami wspomagającymi regulację jego aktywności katalitycznej . Na jego N-końcowym segmencie domena wiążąca Ras (RBD) i domena homologiczna do kinazy C 1 (domena C1) znajdują się obok siebie. Struktury obu konserwatywnych domen zostały rozwiązane w ostatnich dziesięcioleciach, rzucając światło na mechanizmy ich regulacji.

Domena wiążąca Ras wykazuje fałd podobny do ubikwityny (podobnie jak wiele innych małych domen asocjacyjnych z białkiem G) i selektywnie wiąże tylko białka Ras związane z GTP. (Możesz zobaczyć tę interakcję bardzo szczegółowo w polu PDB dołączonym do artykułu. Pokazuje Rap1 w kompleksie z RBD c-Raf.)

Domena C1 – bezpośrednio za domeną wiążącą Ras – jest specjalnym palcem cynkowym , bogatym w cysteiny i stabilizowanym dwoma jonami cynku. Jest podobny do domen C1 wiążących diacyloglicerol kinazy białkowej C (PKC). Ale w przeciwieństwie do PKC, domeny C1 kinaz z rodziny Raf nie wiążą diacyloglicerolu. Zamiast tego wchodzą w interakcje z innymi lipidami, takimi jak ceramidy lub kwas fosfatydowy, a nawet pomagają w rozpoznawaniu aktywowanego Ras (GTP-Ras).

Bliskie sąsiedztwo tych dwóch domen, a także kilka linii danych eksperymentalnych sugeruje, że działają one jako pojedyncza jednostka, która negatywnie reguluje aktywność domeny kinazy białkowej poprzez bezpośrednią interakcję fizyczną. Historycznie, ten autohamujący blok był oznaczony jako region CR1 („Region konserwowany 1”), region zawiasowy nazwano CR2, a domena kinazy CR3. Niestety, dokładna struktura autoinhibitowanej kinazy pozostaje nieznana.

Pomiędzy blokiem domeny autoinhibicyjnej a domeną kinazy katalitycznej znajduje się długi odcinek charakterystyczny dla wszystkich białek Raf. Jest wysoce wzbogacony w aminokwasy seryny , ale jego dokładna sekwencja jest słabo konserwowana w pokrewnych genach Raf. Region ten wydaje się być wewnętrznie nieustrukturyzowany i bardzo elastyczny. Jego najbardziej prawdopodobną rolą jest działanie jako naturalny „zawias” między sztywno złożonymi domenami autohamującymi i katalitycznymi, umożliwiając złożone ruchy i głębokie zmiany konformacyjne w cząsteczce. Ten region zawiasowy zawiera małą, konserwatywną wyspę aminokwasów, które są odpowiedzialne za rozpoznawanie białka 14-3-3 , ale tylko wtedy, gdy kluczowa seryna (Ser259 w ludzkim c-Raf) jest fosforylowana. Drugi, podobny motyw znajduje się na skrajnym C-końcu (wyśrodkowanym wokół zdolnego do fosforylacji Ser 621) wszystkich enzymów Raf, ale poniżej domeny kinazy.

C-końcowa połowa c-Raf fałduje się w pojedynczą domenę białkową, odpowiedzialną za aktywność katalityczną. Struktura tej domeny kinazy jest dobrze znana zarówno z c-Raf, jak i B-Raf. Jest bardzo podobny do innych kinaz Raf i białek KSR i wyraźnie podobny do niektórych innych kinaz MAP3, takich jak rodzina kinaz o mieszanym rodowodzie (MLK). Razem tworzą grupę kinaz białkowych podobnych do kinazy tyrozynowej (TKL). Chociaż niektóre cechy łączą swoje domeny katalityczne z białkowymi kinazami tyrozynowymi, aktywność TKL ogranicza się do fosforylacji reszt seryny i treoniny w białkach docelowych. Najważniejszym substratem kinaz Raf (poza sobą) są MKK1 i MKK2 , których aktywność ściśle zależy od procesów fosforylacji przeprowadzanych przez Rafsa.

Relacje ewolucyjne

Główny artykuł: kinaza Raf

Ludzki c-Raf jest członkiem większej rodziny pokrewnych kinaz białkowych. Dwóch dalszych przedstawicieli – spotykanych u większości kręgowców – należy do tej samej rodziny: B-Raf i A-Raf . Oprócz różnej długości ich niezakonserwowanych końców N- i C-końcowych, wszystkie mają tę samą domenową architekturę, strukturę i regulację. W porównaniu ze stosunkowo dobrze znanymi c-Raf i B-Raf, bardzo mało wiadomo o dokładnej funkcji A-Raf, ale uważa się również, że jest podobny do pozostałych dwóch członków rodziny. Uważa się, że wszystkie te geny są produktem pełnych duplikacji genów lub genomów u zarania ewolucji kręgowców, z pojedynczego genu Raf przodka. Większość innych organizmów zwierzęcych posiada tylko jeden gen Raf. Nazywa się Phl lub Draf u Drosophila i Lin-45 u C. elegans.

Rodzina kinaz Raf (architektury schematyczne)

Zwierzęta wielokomórkowe mają również rodzaj kinazy blisko spokrewniony z Raf: jest to supresor kinazy Ras (KSR). Kręgowce, podobnie jak ssaki, mają dwa paralogiczne geny KSR zamiast jednego: KSR1 i KSR2 . Ich C-końcowa domena kinazy jest bardzo podobna do Raf (pierwotnie nazywana CA5 w KSR i CR3 w Raf), ale N-końcowy region regulatorowy jest inny. Chociaż mają również elastyczny zawias (CA4 w KSR) i domenę C1 (CA3 w KSR), KSR całkowicie nie mają domeny wiążącej Ras. Zamiast tego mają unikalne regiony regulacyjne na swoich N-końcach, pierwotnie określane jako CA1 („obszar chroniony 1”) i CA2. Przez długi czas struktura domeny CA1 była tajemnicą. Jednak w 2012 roku rozwiązano strukturę regionu CA1 w KSR1: okazało się, że jest to rozbieżna SAM (sterylny motyw alfa), uzupełniona cewkami typu coiled-coils (CC-SAM): ma to pomóc KSR w błonie wiążący. KSR, podobnie jak Rafs, mają również bliźniacze motywy asocjacyjne 14-3-3 (które zależą od fosforylacji), ale mają także nowe motywy wiążące MAPK w regionach zawiasowych. Przy typowej sekwencji Phe-x-Phe-Pro (FxFP) motywy te są ważne dla regulacji ze sprzężeniem zwrotnym kinaz Raf w szlaku ERK1/2 . Zgodnie z naszą obecną wiedzą, KSR również uczestniczą w tej samej ścieżce co Raf, chociaż pełnią jedynie rolę pomocniczą. Przy bardzo słabej wewnętrznej aktywności kinazowej przez długi czas uważano je za nieaktywne, aż wreszcie w ostatnich latach wykazano ich aktywność katalityczną. Ale nawet wtedy przyczyniają się tylko nieznacznie do MKK1 i MKK2 . Wydaje się, że główną rolą KSR jest zapewnienie enzymom Raf partnera heterodimeryzacji, znacznie ułatwiając ich aktywację za pomocą allosteryi. Podobne zjawiska opisano dla innych kinaz MAP3. Na przykład ASK2 sam w sobie jest słabym enzymem i wydaje się, że jego aktywność jest związana z heterodimeryzacją ASK1/ASK2.

Kinazy podobne do Raf są całkowicie nieobecne u grzybów. Ale niedawne sekwencjonowanie innych opisthokontów (np. Capsaspora owczarzaki ) ujawniło obecność autentycznych kinaz Raf u jednokomórkowych eukariotów. Dlatego możliwe jest, że białka Raf są starożytnym dziedzictwem, a przodkowie grzybów wtórnie utracili sygnalizację zależną od Raf. grzybiczej kinazy MAP , które są homologiczne do szlaku ERK1/2 ssaków (Fus3 i Kss1 w drożdżach) są aktywowane przez kinazy związane z MEKK (np. Ste11 w drożdżach) zamiast enzymów Raf.

Kinazy Raf występujące w retrowirusach (takich jak mysi v-Raf) pochodzą wtórnie z odpowiednich genów kręgowców ich gospodarzy. Te geny Raf kodują silnie skrócone białka, którym brakuje całej N-końcowej domeny autoinhibicyjnej i motywów wiążących 14-3-3. Wiadomo, że takie ostre skrócenia indukują niekontrolowaną aktywność kinaz Raf: dokładnie tego może potrzebować wirus do wydajnej reprodukcji.

Regulacja działalności

Wrażenie artysty na temat stanu autoinhibicji c-Raf, wzmocnione przez powiązane dimery białka 14-3-3, związane z fosforylowanymi bliźniaczymi motywami.

Jak wspomniano powyżej, regulacja aktywności c-Raf jest złożona. Jako „strażnik” szlaku ERK1/2 jest utrzymywany w ryzach przez wiele mechanizmów hamujących i zwykle nie można go aktywować w jednym kroku. Najważniejszy mechanizm regulacyjny obejmuje bezpośrednie, fizyczne powiązanie N-końcowego bloku autohamującego z domeną kinazy c-Raf. Powoduje to zamknięcie miejsca katalitycznego i całkowite wyłączenie aktywności kinazy. Ten „zamknięty” stan można złagodzić tylko wtedy, gdy domena autoinhibitująca Raf angażuje partnera konkurującego z własną domeną kinazy, przede wszystkim Ras związanym z GTP. Aktywowane małe białka G mogą zatem przerwać interakcje wewnątrzcząsteczkowe: powoduje to zmianę konformacyjną („otwarcie”) c-Raf niezbędną do aktywacji kinazy i wiązania substratu.

Białka 14-3-3 również przyczyniają się do autoinhibicji. Ponieważ wiadomo, że wszystkie białka 14-3-3 tworzą konstytutywne dimery, ich zespoły mają dwa miejsca wiązania. W ten sposób dimer działa jak „molekularne kajdanki”, blokując ich partnerów wiążących w ustalonej odległości i orientacji. Kiedy dokładnie umiejscowione bliźniacze motywy wiążące 14-3-3 są zaangażowane przez pojedynczy dimer białka 14-3-3 (taki jak 14-3-3 zeta), zostają zablokowane w konformacji, która promuje autoinhibicję i nie pozwala na odłączenie domen autoinhibitorowych i katalitycznych. To „blokowanie” c-Raf (i innych Rafs, jak również KSR) jest kontrolowane przez fosforylację motywu. Niefosforylowane motywy asocjacyjne 14-3-3 nie wiążą swoich partnerów: najpierw muszą zostać ufosforylowane na konserwowanych serynach (Ser 259 i Ser 621) przez inne kinazy białkowe. Najważniejszą kinazą biorącą udział w tym zdarzeniu jest kinaza 1 aktywowana przez TGF-beta (TAK1), a enzymami przeznaczonymi do usuwania tych fosforanów są kompleksy fosfatazy białkowej 1 (PP1) i fosfatazy białkowej 2A (PP2A).

Należy zauważyć, że wiązanie 14-3-3 enzymów Raf niekoniecznie jest hamujące: gdy Raf jest otwarty i dimeryzuje, 14-3-3s może również wiązać się w trans , łącząc dwie kinazy i „skuwając” je razem, aby wzmocnić dimer zamiast trzymając ich z dala od siebie. Istnieją również inne tryby interakcji 14-3-3 z c-Raf, ale ich rola nie jest dobrze znana.

Dimeryzacja jest kolejnym ważnym mechanizmem regulacji aktywności c-Raf i jest wymagana do fosforylacji pętli aktywacji Raf . Zwykle tylko „otwarte” domeny kinazy uczestniczą w dimeryzacji. W przeciwieństwie do B-Raf, który łatwo tworzy ze sobą homodimery, c-Raf preferuje heterodimeryzację z B-Raf lub KSR1. [ potrzebne źródło ] Homodimery i heterodimery zachowują się podobnie. Struktura domeny homodimeru kinazy B-Raf wyraźnie pokazuje, że pętle aktywacyjne (które kontrolują aktywność katalityczną wszystkich znanych kinaz białkowych) są umieszczone w konformacji podobnej do aktywnej w dimerze. Wynika to z allosterycznego efektu wiązania drugiej cząsteczki z „tylną” stroną kinazy; takie dimery są symetryczne i mają dwa częściowo aktywne miejsca katalityczne. Na tym etapie aktywność kinaz Raf jest niska i niestabilna.

Cykl aktywacji ssaczych białek Raf na przykładzie B-Raf (znacznie uproszczony przegląd, nie pokazujący wszystkich etapów).

Aby osiągnąć pełną aktywność i ustabilizować stan aktywny, pętla aktywacyjna c-Raf musi zostać ufosforylowana. Jedynymi obecnie znanymi kinazami, które wykonują ten akt, są same kinazy z rodziny Raf. Ale niektóre inne kinazy, takie jak PAK1, mogą fosforylować inne reszty w pobliżu domeny kinazy c-Raf: dokładna rola tych kinaz pomocniczych jest nieznana. W kontekście c-Raf, zarówno c-Raf, jak i KSR1 są potrzebne do etapu „transfosforylacji”. Ze względu na architekturę dimerów ta fosforylacja może zachodzić tylko w układzie trans (tj. jeden dimer fosforyluje inny w czteroczłonowym kompleksie przejściowym). Poprzez interakcję z konserwowanymi resztami Arg i Lys w domenie kinazy, fosforylowane pętle aktywacyjne zmieniają konformację i stają się uporządkowane, trwale blokując domenę kinazy w stanie w pełni aktywnym, aż do defosforylacji. Fosforylowane pętle aktywacyjne powodują również, że kinaza jest niewrażliwa na obecność jej domeny autohamującej. KSR nie mogą przejść tego ostatniego etapu, ponieważ brakuje im wszelkich reszt ulegających fosforylacji w ich pętlach aktywacyjnych. Ale kiedy c-Raf jest w pełni aktywowany, nie ma już takiej potrzeby: aktywne enzymy Raf mogą teraz angażować swoje substraty. Podobnie jak większość kinaz białkowych, c-Raf ma wiele substratów. BAD (Bcl2-atagonista śmierci komórkowej) jest bezpośrednio fosforylowany przez c-Raf, wraz z kilkoma typami cyklaz adenylanowych , fosfatazą miozynową (MYPT), troponiną T mięśnia sercowego (TnTc) itp. Białko siatkówczaka (pRb) i fosfataza Cdc25 zostały również zasugerowane jako możliwe substraty.

Najważniejszymi celami wszystkich enzymów Raf są MKK1(MEK1) i MKK2(MEK2) . Chociaż struktura kompleksu enzym-substrat c-Raf:MKK1 jest nieznana, można go dokładnie modelować na podstawie kompleksu KSR2:MKK1. Tutaj nie zachodzi żadna rzeczywista kataliza, ale uważa się, że jest ona bardzo podobna do sposobu, w jaki Raf wiąże się ze swoimi substratami. Główny interfejs interakcji zapewniają płaty C-końcowe obu domen kinazy; duża, nieuporządkowana, bogata w prolinę pętla, unikalna dla MKK1 i MKK2 , również odgrywa ważną rolę w jej pozycjonowaniu względem Raf (i KSR). Te MKK ulegają fosforylacji w co najmniej dwóch miejscach w swoich pętlach aktywacyjnych po związaniu z Raf: to również je aktywuje. Celem kaskady kinaz są ERK1 i ERK2, które są selektywnie aktywowane przez MKK1 lub MKK2. ERK mają liczne substraty w komórkach; są również zdolne do przemieszczania się do jądra w celu aktywacji jądrowych czynników transkrypcyjnych. Aktywowane ERK są plejotropowymi efektorami fizjologii komórki i odgrywają ważną rolę w kontroli ekspresji genów zaangażowanych w cykl podziału komórki, migrację komórek, hamowanie apoptozy i różnicowanie komórek.

Powiązane choroby człowieka

Dziedziczne mutacje c-Raf związane ze wzmocnieniem funkcji są zaangażowane w niektóre rzadkie, ale ciężkie zespoły. Większość z tych mutacji obejmuje zmiany pojedynczych aminokwasów w jednym z dwóch motywów wiążących 14-3-3. Mutacja c-Raf jest jedną z możliwych przyczyn zespołu Noonan : osoby dotknięte chorobą mają wrodzone wady serca, niski i dysmorficzny wzrost oraz kilka innych deformacji. Podobne mutacje w c-Raf mogą również powodować pokrewny stan, określany jako zespół LEOPARD (soczewica soczewicowata, nieprawidłowości elektrokardiograficzne, hiperteloryzm gałki ocznej, zwężenie płuc, nieprawidłowe narządy płciowe, opóźnienie wzrostu, głuchota), ze złożonym powiązaniem defektów.

Rola w raku

Chociaż c-Raf jest bardzo wyraźnie zdolny do mutacji w onkogen w warunkach eksperymentalnych, a nawet w kilku ludzkich nowotworach, jego siostrzana kinaza B-Raf jest prawdziwym głównym graczem w karcynogenezie u ludzi.

Mutacje B-Raf

Około 20% wszystkich zbadanych próbek ludzkiego guza wykazuje zmutowany gen B-Raf. Przytłaczająca większość tych mutacji obejmuje wymianę pojedynczego aminokwasu: Val 600 na Glu, a ten nieprawidłowy produkt genu (BRAF-V600E) można uwidocznić za pomocą immunohistochemii w klinicznej diagnostyce molekularnej. przeskakując wszystkie etapy kontrolne przy normalnej aktywacji - natychmiast uaktywnij domenę kinazy. Ponieważ B-Raf może również aktywować się przez homodimeryzację, a c-Raf przez heterodimeryzację, ta mutacja ma katastrofalny efekt, zmieniając konstytutywnie aktywny szlak ERK1/2 i napędzając niekontrolowany proces podziału komórki.

Jako cel terapeutyczny

Ze względu na znaczenie zarówno mutacji Ras, jak i B-Raf w powstawaniu nowotworów, opracowano kilka inhibitorów Raf do zwalczania raka, zwłaszcza przeciwko B-Raf wykazujące mutację V600E. Sorafenib był pierwszym klinicznie użytecznym lekiem, który stanowi farmakologiczną alternatywę w leczeniu wcześniej w dużej mierze nieuleczalnych nowotworów złośliwych, takich jak rak nerkowokomórkowy i czerniak. Śledzono kilka innych cząsteczek, takich jak wemurafenib , regorafenib , dabrafenib itp.

Niestety, współzawodniczące z ATP inhibitory B-Raf mogą mieć niepożądany efekt w przypadku nowotworów zależnych od K-Ras: są po prostu zbyt selektywne dla B-Raf. Chociaż doskonale hamują aktywność B-Raf w przypadku, gdy zmutowany B-Raf jest głównym winowajcą, promują również homo- i heterodimeryzację B-Raf, z samym sobą i c-Raf. To w rzeczywistości wzmocni aktywację c-Raf zamiast ją hamować w przypadku braku mutacji w genach Raf, ale ich wspólny aktywator, białko K-Ras, jest zmutowane. Ta „paradoksalna” aktywacja c-Raf wymaga badań przesiewowych pod kątem mutacji B-Raf u pacjentów (poprzez diagnostykę genetyczną) przed rozpoczęciem terapii inhibitorem B-Raf.

Lista białek oddziałujących

Wykazano, że C-Raf wchodzi w interakcje z:

Zobacz też

Dalsza lektura

Linki zewnętrzne

Pobrano z „ https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=C-Raf&oldid=1116137374 ”