Clostridium difficile toksyna A
| Identyfikatory | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| toksyny A | |||||||
| Organizm | |||||||
| Symbol | toxA | ||||||
| Alt. symbolika | tcdA | ||||||
| Entrez | 4914076 | ||||||
| RefSeq (Prot) | YP_001087137.1 | ||||||
| UniProt | P16154 | ||||||
| Inne dane | |||||||
| numer WE | 2.4.1.- | ||||||
| Chromosom | genom: 0,79 - 0,81 Mb | ||||||
| |||||||
,encoding_the_large_clostridial_toxins(LCTs)_involved_in_C._difficile_infections_CDI.png)
Clostridium difficile Toxin A (TcdA) jest toksyną wytwarzaną przez Clostridioides difficile , wcześniej znaną jako Clostridium difficile . Jest podobny do toksyny B Clostridium difficile . Toksyny są głównymi czynnikami wirulencji wytwarzanymi przez Gram-dodatnie , beztlenowe bakterie Clostridioides difficile . Toksyny działają uszkadzając błonę śluzową jelita i powodują objawy zakażenia C. difficile , w tym rzekomobłoniaste zapalenie jelita grubego .
TcdA jest jedną z największych znanych toksyn bakteryjnych. Przy masie cząsteczkowej 308 kDa jest zwykle opisywana jako silna enterotoksyna , ale ma również pewną aktywność jako cytotoksyna . Toksyna działa poprzez modyfikację białek GTPazy komórki gospodarza poprzez glukozylację, co prowadzi do zmian w aktywności komórkowej. Czynnikami ryzyka zakażenia C. difficile jest leczenie antybiotykami, które może zakłócać normalną mikroflorę jelitową i prowadzić do kolonizacji bakteriami C. difficile .
gen tcdA
Gen zawiera otwartą ramkę odczytu (ORF) złożoną z 8133 nukleotydów , kodującą 2710 aminokwasów . TcdA i TcdB mają 63% homologii w swoich sekwencjach aminokwasowych. Geny te ulegają ekspresji podczas późnej fazy logarytmicznej i fazy stacjonarnej w odpowiedzi na czynniki środowiskowe. Stresy środowiskowe, takie jak antybiotyki i represja kataboliczna, mogą wpływać na ekspresję toksyn.
Miejsce patogeniczności
tcdA i tcdB znajdują się na chromosomie Clostridioides difficile w locus patogenności o długości 19,6 kb (PaLoc), które można znaleźć tylko w toksycznych szczepach C. difficile . Szczepy nietoksyczne zawierają fragment o 127 parach zasad zastępujący PaLoc. Locus ten zawiera również trzy inne geny pomocnicze tcdC , tcdR i tcdE . Ekspresja TcdC jest wysoka podczas wczesnej fazy wykładniczej i spada, gdy wzrost przechodzi do fazy stacjonarnej , zgodnie ze wzrostem ekspresji tcdA i tcdB . W związku z tym wzorce ekspresji wskazały tcdC jako możliwy negatywny regulator produkcji toksyn. tcdR może służyć jako pozytywny regulator produkcji toksyn. Spekulowano, że tcdE ułatwia uwalnianie TcdA i TcdB poprzez aktywność lityczną na błonie komórkowej bakterii. Ze względu na swoją homologię z innymi białkami o podobnej funkcji, jak również lokalizację genu między tcdA i tcdB , przewiduje się, że tcdE będzie działać jako białko lityczne, które ułatwia uwalnianie, ponieważ TcdA i TcdB nie mają peptydu sygnałowego do wydzielania .
Struktura
Białko zawiera trzy domeny. N-końcowa domena aminowa zawiera miejsce aktywne odpowiedzialne za aktywność glukozylującą toksyny. Zarówno TcdA, jak i TcdB wykorzystują ten wysoce konserwatywny region N-końcowy (74% homologii między obiema toksynami) do zmiany identycznych substratów .
C-końca karboksylowego zawiera powtarzające się jednostki odpowiedzialne za wiązanie receptora na powierzchni komórek docelowych. Te krótkie homologiczne powtarzające się jednostki nazwano złożonym powtarzalnym oligopeptydem (CROP). Niedawne badanie pokazuje, że CROP określają siłę TcdA poprzez interakcje ze strukturami na powierzchni komórki. Te regiony CROP mają od 21 do 50 reszt i odgrywają rolę w wiązaniu receptora. Ten C-końcowy powtarzalny region jest oznaczony jako region immunodominujący, ponieważ ligandu może być blokowane przez przeciwciała monoklonalne specyficzne dla tego regionu. Region ten zawiera najbardziej hydrofilową część cząsteczki.
, że centralnie położona domena hydrofobowa zawierająca grupę 172 wysoce konserwatywnych hydrofobowych aminokwasów jest ważna dla translokacji enzymatycznej części białka.
Mechanizm akcji
TcdA musi zostać zinternalizowany do komórki gospodarza poprzez endocytozę , aby uzyskać dostęp do cytozolu . Wiązanie z receptorem jest pierwszym krokiem wymaganym do wejścia do komórki poprzez endocytozę w kwaśnym endosomie . Niskie pH w endosomie indukuje zmiany strukturalne, takie jak odsłonięcie domen hydrofobowych, które są kluczowe dla funkcji TcdA.
N-końcowa domena TcdA działa jako katalizator reakcji glukotransferazy, która przenosi cząsteczkę glukozy z UDP-glukozy i kowalencyjnie przyłącza ją do konserwatywnych aminokwasów w cząsteczkach docelowych. Dlatego TcdA katalizuje glukozylację, a następnie nieodwracalną inaktywację cząsteczek docelowych w rodzinie Ras małych GTPaz. Te cząsteczki docelowe obejmują RhoA , Rac i Cdc42 , które są białkami regulatorowymi eukariotycznego cytoszkieletu aktynowego i modulatorami wielu różnych komórkowych szlaków sygnałowych.
Cele wewnątrzkomórkowe
TcdA celuje głównie w Rho , Rac i Cdc42 . Cząsteczki te są ważnymi regulatorami sygnalizacji komórkowej. Małe GTPazy, takie jak Rho, Rac i Cdc42, regulują swoją aktywność, naprzemiennie między aktywnym GTP a nieaktywnym stanem związanym z GDP . Czynniki wymiany guaniny (GEF) regulują wymianę GTP i GDP .
TcdA glukozyluje RhoA poprzez przeniesienie cząsteczki glukozy z UDP-glukozy , cukru nukleotydowego, do Thr-37 GTPazy RhoA. W Rac i Cdc42 ugrupowanie cukrowe jest przenoszone do Thr-35. Glukozylacja uniemożliwia prawidłowe wiązanie GTP i blokuje aktywację. TcdA działa preferencyjnie na postać białek GTPazy związaną z GDP, ponieważ ta konfiguracja odsłania resztę treoniny , która jest glukozylowana przez toksynę.
RhoA reguluje cytoszkielet aktynowy i tworzy włókna stresowe oraz zrosty ogniskowe . Kiedy RhoA jest inaktywowane przez TcdA, jego interakcja z efektorami w dół jest hamowana. Prowadzi to do zmian w cytoszkielecie aktynowym, które zwiększają przepuszczalność nabłonka jelitowego . Rac i Cdc42 biorą udział w tworzeniu filopodium , które jest kluczowe dla ruchu i migracji komórek. Ogólnie rzecz biorąc, wszystkie Rho , Rac i Cdc42 regulują procesy w komórkach, które są zależne od polimeryzacji aktyny. Wiele efektów fizjologicznych, których doświadczają komórki po ekspozycji na TcdA, można powiązać z rozregulowaniem polimeryzacji aktyny i szlaków komórkowych kontrolowanych przez cele TcdA.
Efekty fizjologiczne
Morfologia komórki
Ekspozycja na TcdA prowadzi do natychmiastowych zmian w morfologii komórki, w tym utraty integralności strukturalnej z powodu zmniejszenia aktyny nitkowatej ( F-aktyny ) i wzrostu aktyny kulistej . Dezorganizacja włókien aktynowych i cytoszkieletu prowadzi do zwiększonej przepuszczalności połączeń ścisłych , co skutkuje poważnym uszkodzeniem komórek nabłonka i wydzielaniem płynów. Nagromadzenie i wydzielanie płynu są wtórne do uszkodzenia błony śluzowej, które występuje po ekspozycji na TcdA. Wyraźne zmiany w mikrofilamentów prowadzą do zaokrąglenia komórek i śmierci komórek. Zmiany te wynikają z inaktywacji Rho , które odgrywają ważną rolę w regulacji połączeń ścisłych .
apoptoza
Najbardziej prawdopodobnym mechanizmem odpowiedzialnym za śmierć komórek narażonych na działanie TcdA jest apoptoza . Inaktywacja Rho może aktywować kaspazę-3 i kaspazę-9 ; dwa kluczowe elementy szlaku apoptozy. TcdA powiązano z błony mitochondrialnej i uwolnieniem cytochromu C poprzez aktywację kaspazy i inaktywację Rho , co dodatkowo sugeruje, że TcdA jest zdolny do indukowania apoptozy.
Znaczenie kliniczne
Clostridioides difficile (CDAD)
Modele zwierzęce wykazały, że TcdA obejmuje biegunkę, naciek neutrofili , zapalenie błony śluzowej jelit i martwicę komórek nabłonka . Toksyna ta jest uważana za główną przyczynę CDAD. TcdA uszkadza końcówki kosmków jelitowych, co zakłóca rąbka szczoteczkowego , prowadząc do erozji komórek i wycieku płynu z uszkodzonego obszaru. To uszkodzenie i związana z nim odpowiedź płynowa powoduje biegunkę związaną z Clostridioides difficile .
Rzekomobłoniaste zapalenie jelita grubego
TcdA może wywoływać zmiany fizjologiczne, które występują w rzekomobłoniastym zapaleniu jelita grubego (PMC) związanym z C. difficile , ciężkim owrzodzeniu okrężnicy. Uszkodzenie błony śluzowej okrężnicy przez toksyny sprzyja gromadzeniu się fibryny , mucyny i martwych komórek, tworząc warstwę resztek w okrężnicy (błonie rzekomej), powodując reakcję zapalną . Uszkodzenie TcdA powoduje zwiększoną przepuszczalność nabłonka, cytokin i chemokin , infiltrację neutrofilów, produkcję reaktywnych form tlenu (ROS), aktywację komórek tucznych i bezpośrednie uszkodzenie błony śluzowej jelit. Wszystko to można przypisać inaktywacji Rho GTPazy indukowanej przez TcdA . Utrata ścisłych połączeń może zapewnić wejście neutrofili do jelit, prowadząc do ich gromadzenia; znak rozpoznawczy PMC. Indukowana przez TcdA produkcja cytokin IL-8 i innych mediatorów stanu zapalnego przyczynia się do stadiów zapalenia obserwowanych w PMC. Infiltracja przez neutrofile, makrofagi i komórki tuczne w odpowiedzi na uszkodzenie TcdA zwiększa odpowiedź zapalną poprzez wytwarzanie i uwalnianie innych mediatorów, takich jak czynnik martwicy nowotworu alfa , IL-1 , IL-6 i inne monokiny . Mediatory te powodują dodatkowe uszkodzenie błony śluzowej jelit i dodatkowo zwiększają odpowiedź zapalną, wpływając na trwałość PMC. Jeśli dojdzie do rozległego uszkodzenia ściany jelita, bakterie mogą dostać się do krwioobiegu i spowodować wstrząs septyczny i śmierć.
Wykrywanie i diagnostyka toksyn
TcdA i TcdB są obecne w supernatantach hodowli Clostridium difficile i można je oczyścić z przesączu. Obie toksyny są konsekwentnie wykrywane w próbkach kału ludzi i zwierząt i są obecnie używane jako markery do diagnozowania C. difficile . U ponad 90% pacjentów zakażonych C. difficile stwierdzono aktywność cytotoksyczną w kale. Glukozylacja GTPaz Rho dezaktywuje białka GTPazy, prowadząc do zapadnięcia się cytoszkieletu, co powoduje zaokrąglenie komórek. Opracowano test hodowli tkankowej do wykrywania C. difficile w próbkach kału. Test zaokrąglania komórek (test cytotoksyczności) został opracowany do diagnozowania C. difficile . Do wykrywania TcdA i TcdB za pomocą swoistych przeciwciał zastosowano testy immunoenzymatyczne (ELISA) . W połączeniu z testem ELISA test cytotoksyczności jest „złotym standardem” w przypadku komórek Vero do diagnozy C. difficile .
Znaczenie TcdA i TcdB w infekcji C. difficile
Od lat 80. i wczesnych 90. rola TcdA i TcdB w zakażeniu C. difficile była szeroko dyskutowana. Wcześniejsze doniesienia o oczyszczonych toksynach wskazywały, że sam TcdA wystarczył do wywołania objawów infekcji, a TcdB nie był w stanie tego zrobić, chyba że został połączony z TcdA. Nowszy eksperyment wykazał, że TcdB był w rzeczywistości niezbędny do wirulencji . Wcześniejsze badania ustaliły, że TcdA jest wyłącznie enterotoksyną , a TcdB cytotoksyną , ale później stwierdzono , że obie toksyny mają ten sam mechanizm działania. Aby w pełni zbadać rolę obu toksyn w patogenezie C. difficile , opracowano system nokautu genów w modelu infekcji chomika. Poprzez trwałe wyeliminowanie tcdA , tcdB lub obu (podwójne wyeliminowanie) wykazano, że C. difficile wytwarzająca jedną lub obie toksyny była zdolna do działania cytotoksycznego, a aktywność ta przekładała się bezpośrednio na wirulencję in vivo . Stwierdzono również, że zjadliwość podwójnego tcdAtcdB była całkowicie osłabiona . Ogólnie rzecz biorąc, badania te wykazały znaczenie zarówno TcdA, jak i TcdB w C. difficile , pokazując, że każda z toksyn jest zdolna do cytotoksyczności.
