kalcyseptyna

Kalcyseptyna
Model struktury 3D kalcyseptyny oparty na strukturze NMR jej homologu FS2 (​). Mostki dwusiarczkowe są pokazane na żółto. Trzy reszty, które różnią się między FS2 i kalcyseptyną, pokazano na czerwono.
Identyfikatory
Organizm	Dendroaspis polylepis polylepis
Symbol	CaS
UniProt	P22947
Szukaj Struktury Model szwajcarski Domeny InterPro

Kalcyseptyna ( CaS ) jest naturalną neurotoksyną wyizolowaną z mamby czarnej Dendroaspis p. jad polilepowy . Ta toksyna składa się z 60 aminokwasów z czterema wiązaniami dwusiarczkowymi . Kalcyseptyna specyficznie blokuje kanały wapniowe typu L , ale nie inne zależne od napięcia kanały Ca2 ^{+ , takie jak kanały typu N i typu T.}

Historia

Mamba czarna ( Dendroaspis polylepis ) jest powszechnie uważana za jeden z najbardziej śmiercionośnych węży na świecie i jest odpowiedzialna za wiele ofiar śmiertelnych w całej Afryce Subsaharyjskiej . Bez leczenia ukąszenie czarnej mamby powoduje 100% śmiertelność.

Jad czarnej mamby składa się z ponad 28 peptydów. Jednym z takich peptydów jest kalcyseptyna. Stanowi 2,8% jadu czarnej mamby . Po pierwszym oczyszczeniu peptyd nazwano białkiem E3, które zostało później zmienione na kalcyseptynę przez Weille i in.

Znaczenie

Wykazano, że kalcyseptyna specyficznie hamuje kanały Ca2 ^{+ bramkowane napięciem typu L} i była pierwszym odkrytym naturalnym polipeptydem o tej właściwości. Specyficzne inhibitory polipeptydowe kanałów wrażliwych na napięcie są ważnymi narzędziami badawczymi i były już znane dla wrażliwych na napięcie kanałów Na ⁺ , zarówno wrażliwych na napięcie, jak i aktywowanych Ca ^{2+ kanałów K +} oraz dla kanałów Ca ^{2+ typu N} .

Zanim kalcyseptyna została zsekwencjonowana i wykazano, że jest specyficznym inhibitorem kanału wapniowego typu L , nie były znane żadne specyficzne inhibitory polipeptydowe dla tego typu kanałów bramkowanych napięciem. Specyficznymi blokerami kanału typu L były małe cząsteczki organiczne, takie jak 1,4- dihydropirydyny . Sugerowano, że w jadzie węży można znaleźć inhibitory polipeptydów. Kalcyseptyna potwierdziła to, ponieważ wykazano, że nie tylko specyficznie blokuje kanały typu L, ale także robi to dokładnie w tym samym miejscu, co 1,4- dihydropirydyny . Po kalcyseptynie znaleziono również inne polipeptydy specyficznie blokujące kanały typu L: FS2, C10S2C2 i S4C8.

Izolacja/Synteza

Kalcyseptynę można znaleźć tylko w czarnej mambie i można ją oczyścić z surowego jadu. Węża można wydoić, aby uzyskać jad. Schweitz i in. zastosował trójetapową metodę oczyszczania kalcyseptyny do homologii. Trzy etapy obejmowały: 1) filtrację żelową, 2) wymianę jonową na TSK SP 5PW i 3) chromatografię w układzie faz odwróconych na RP18.

Naukowcom udało się również zsyntetyzować kalcyseptynę w laboratorium. FS2, który jest kolejnym składnikiem jadu czarnej mamby i jest homologiczny do kalcyseptyny, można również zsyntetyzować w laboratorium.

Struktura

Rodzina toksyn trójpalczastych

Główny artykuł: Toksyna trzech palców

Kalcyseptyna należy do rodziny toksycznych peptydów występujących w jadzie węży. Białka z tej rodziny są małe i składają się z 58 do 74 aminokwasów. Wszystkie mają tę samą trójpalczastą strukturę, która powstaje w wyniku utworzenia czterech mostków dwusiarczkowych między ośmioma resztami cysteiny.

Aktywność tych toksyn - choć należą do tej samej rodziny - jest w rzeczywistości dość zróżnicowana i może wahać się od blokowania receptorów acetylocholiny do zmiany przepuszczalności błony. Ich wspólną cechą jest to, że wszystkie w jakiś sposób wpływają na transdukcję sygnału.

Sekwencja i struktura

Sama kalcyseptyna składa się z 60 aminokwasów i została w pełni zsekwencjonowana:

RICYIHKASL PRATKTCVEN TCYKMFIRTQ REYISERGCG CPTAMWPYQT ECCKGDRCNK

Trójwymiarowa struktura kalcyseptyny nie została określona eksperymentalnie. Jednak inna toksyna znajdująca się w jadzie mamby czarnej, zwana FS2, sekwencyjnie różni się od kalcyseptyny tylko trzema resztami: zawiera serynę zamiast izoleucyny w pozycji 5, histydynę zamiast glutaminy w pozycji 30 i glutaminę zamiast kwasu glutaminowego w pozycji 30. pozycja 32. Trójwymiarową strukturę FS2 określono za pomocą NMR i ze względu na niewielkie różnice sekwencyjne może ona służyć jako model struktury kalcyseptyny.

Toksykokinetyka

Absorpcja i dystrybucja

Ponieważ kalcyseptyna jest wstrzykiwana przez węża do ofiary wraz z resztą jej jadu, nie musi ona przechodzić przez barierę ochronną skóry i jest wstrzykiwana bezpośrednio do tkanek i/lub krwiobiegu ofiary. Nie przeprowadzono żadnych badań dotyczących toksykokinetyki kalcyseptyny , ale dostępne są ogólne badania dotyczące dynamiki toksyn węża. Chociaż toksyczne peptydy są na ogół małe (około 60 aminokwasów), ich wielkość jest wystarczająca, aby uniemożliwić im przekraczanie warstw nabłonka, takich jak bariera krew-mózg .

biodostępności przeprowadzono dla kilku jadów węży. Na przykład stwierdzono, że kobry ma biodostępność 41,7% po wstrzyknięciu domięśniowym, aw przypadku innych jadów może to być nawet mniej niż 10%. Wartości te są dość niskie w porównaniu z większością leków terapeutycznych, które po podaniu domięśniowym mają zazwyczaj blisko 100% biodostępność. Ogólnie stwierdzono, że toksyczne peptydy o długości 10-40 aminokwasów mają stosunkowo słabą biodostępność ze względu na ich wielkość i hydrofilowość. Zatem oczekuje się, że kalcyseptyna, zawierająca 60 aminokwasów, również będzie miała niską biodostępność.

Metabolizm

Ponieważ kalcyseptyna jest peptydem, teoretycznie może być rozkładana przez proteazy w tkankach, do których jest wstrzykiwana. Stwierdzono, że trawienie toksycznych peptydów węży przez proteazy zachodzi w tkankach ofiary, ale ze względu na względną stabilność toksyn, szybkość działania toksyn i ilość wstrzykniętego jadu nie jest to wystarczające do ochrony przed skutki ukąszenia węża. To samo dotyczy układu odpornościowego: jest mało prawdopodobne, aby większe peptydy jadu zostały pominięte przez układ odpornościowy, ale działanie immunologiczne nie jest wystarczająco szybkie, aby przeciwdziałać skutkom jadu.

Jak wspomniano powyżej, kalcyseptyna ma trójpalczastą strukturę powszechnie występującą w toksynach. Chociaż wiele toksyn ma taką strukturę, ich funkcje są zróżnicowane. Powodem, dla którego ta struktura jest tak bardzo zachowana, jest prawdopodobnie jej stabilność: mostki cysteinowe tworzą stabilny rdzeń, który prawdopodobnie spowalnia rozkład białka przez proteazy.

Mechanizm akcji

Wykazano, że kalcyseptyna blokuje kanały wapniowe typu L, hamując w ten sposób skurcz mięśni gładkich i czynność serca.

Kanały wapniowe aktywowane napięciem

Zależne od napięcia kanały wapniowe są ważne dla generowania sygnałów elektrycznych w komórkach pobudliwych, takich jak neurony i komórki mięśnia sercowego lub mięśni gładkich . Kanały Ca ²⁺ typu N znajdują się w komórkach nerwowych i odgrywają ważną rolę w sprzęganiu pobudzenia nerwów i wydzielania neuroprzekaźników . Kanały wapniowe typu L są obecne w komórkach mięśnia sercowego i mięśni gładkich, łącząc pobudzenie ze skurczem mięśni. Inne typy aktywowanych napięciem kanałów Ca2 ⁺ obejmują kanały typu T i typu P.

Blokowanie kanałów wapniowych typu L

Ponieważ obecność wapnia w cytozolu jest niezbędna do skurczu mięśni, blokery kanałów wapniowych zapobiegają budowaniu napięcia mięśni. Blokery kanałów wapniowych typu L , które występują w mięśniach sercowych i mięśniach gładkich , działają więc jako środki zwiotczające mięśnie gładkie i hamujące skurcze mięśnia sercowego. Powszechnymi blokerami kanałów wapniowych typu L są 1,4- dihydropirydyny , które są stosowane w leczeniu chorób układu krążenia. Dzięki działaniu rozkurczającemu mogą rozluźniać mięśnie gładkie otaczające naczynia krwionośne, rozszerzając je i obniżając ciśnienie krwi.

Kalcyseptyna jako bloker kanału wapniowego typu L

swoim działaniem biologicznym przypomina wspomniane 1,4- dihydropirydyny , gdyż ma taką samą zdolność wiązania i blokowania kanałów wapniowych typu L w mięśniu gładkim i mięśniu sercowym.

Aminokwasy odpowiedzialne za wiązanie i blokowanie kanałów wapniowych typu L znajdują się prawdopodobnie w trzecim „palcu” struktury kalcyseptyny, gdzieś pomiędzy aminokwasami 40 a 50. Chociaż peptydy z rodziny trójpalczastych mają podobną budowę, tylko niektóre z nich są zdolne do wiązania i blokowania kanałów wapniowych. Wielokrotne badania dopasowania sekwencji dały 12 reszt aminokwasowych, które były unikalne dla toksyn o działaniu blokującym kanały. Reszty te znajdują się na końcach pętli II i III w strukturze trójpalczastej. Zaproponowano model, w którym uważa się, że aminokwasy 45 do 48, MWPY toksyny FS2 wiążą kanały wapniowe. Model ten opiera się na przewidywaniu interakcji tych aminokwasów z kanałem wapniowym. Te interakcje przypominają właściwości hydrofobowe i wiążące wodorowe nifedypiny , znanego blokera 1,4-dihydropirydyny. Ze względu na podobieństwa między kalcyseptyną i FS2 model ten może również uwzględniać interakcje kalcyseptyny z kanałami wapniowymi typu L.

Inny model opiera się na większym segmencie tej samej pętli, zawierającym aminokwasy od 42 do 47, PTAMWP. Ponieważ często stwierdzano, że miejsca interakcji białko-białko są otoczone prolinami, obecność dwóch prolin w tym „palcu” struktury wskazuje na możliwe miejsce interakcji. Stwierdzono, że krótki polipeptyd złożony z ośmiu reszt aminokwasowych, zawierający tę sekwencję, faktycznie blokuje kanały wapniowe typu L, chociaż z mniejszą aktywnością.

Te oddziałujące aminokwasy znajdują się również w dwóch innych białkach blokujących kanały wapniowe typu L, C10S2C2 i S4C8. Chociaż obie te toksyny należą do rodziny trójpalczastych, trójpalczasta struktura prawdopodobnie nie jest wymagana do blokowania kanałów: inne toksyny węży, w tym dendrotoksyna , mają podobny wpływ na różne kanały, ale nie wykazują trójpalczastych Struktura.

Wskazania/Objawy

Typowe objawy po ugryzieniu przez czarną mambę to nagłe zawroty głowy, senność i kaszel oraz trudności w oddychaniu. Inne prawdopodobne objawy obejmują drgawki, objawy nerwowo-mięśniowe, wstrząs, utratę przytomności, niedociśnienie , ataksję , nadmierne ślinienie , porażenie kończyn, nudności i wymioty, gorączkę i silny ból brzucha. Trwałe porażenie kończyn jest bardzo prawdopodobne, jeśli ukąszenie pozostaje nieleczone. W najcięższym przypadku, nieleczone, ukąszenie Czarnej Mamby może doprowadzić do śmierci przez uduszenie w wyniku porażenia mięśni oddechowych.

Wszystkie te objawy są spowodowane kombinacją wszystkich toksycznych peptydów, które zawiera surowy jad czarnej mamby. Objawy są związane z kalcyseptyną, ponieważ działa ona również jako środek zwiotczający mięśnie gładkie, co wyjaśnia wczesne pojawienie się trudności w oddychaniu, porażenie kończyn, a nawet śmierć przez uduszenie. Wiadomo, że kalcyseptyna ma hipotensyjne . Nie można jednoznacznie ustalić, który peptyd jest najbardziej odpowiedzialny za który objaw, ponieważ kombinacje różnych toksyn mogą mieć różne skutki.

Antidotum

W przypadku ukąszenia przez mambę czarną ofiarę należy leczyć zgodnie ze standardowym protokołem. Najważniejszą częścią tego leczenia jest dożylne wstrzyknięcie wielowartościowej antytoksyny . Południowoafrykańscy producenci szczepionek produkują tę antytoksynę. Wielowartościowy oznacza, że ​​może być używany do różnych ukąszeń węży: żmij , mamby i kobry . Aby przeciwdziałać skutkom jadu, należy wstrzyknąć duże ilości antytoksyny.

Poliwalentna antytoksyna jest wytwarzana przez wstrzykiwanie koniom dostosowanego jadu. Jad jest najpierw odtruwany, aby zapobiec zbyt dużym uszkodzeniom i śmierci. Odbywa się to głównie poprzez kompleksowanie jadu z aldehydem , takim jak formalina. Jad podaje się również z adiuwantem , takim jak wodorotlenek glinu lub alginian sodu, w celu pobudzenia odpowiedzi immunologicznej. Po wstrzyknięciu jadu organizm wytwarza przeciwciała . Wiążą one składniki – zmienność peptydów – jadu, które uniemożliwiają dalszą aktywność cząsteczki i są ostatecznie usuwane przez układ odpornościowy organizmu. Te przeciwciała są zbierane i oczyszczane z krwi, a następnie pakowane głównie w postaci płynnej. Konie są wykorzystywane ze względu na dużą objętość krwi. Końcowy produkt antytoksyny traci ważność po 5 latach i należy go przede wszystkim przechowywać w chłodnym miejscu, w temperaturze 4-8 °C. Może jednak przetrwać różne sytuacje środowiskowe przez kilka tygodni do miesięcy, nie tracąc swojej mocy.

Ponieważ z czasem wstrzykuje się kilka jadów różnych węży, koń wytworzy różne przeciwciała przeciwko wszystkim jadom. To nadaje antyteninie jej poliwalentną właściwość. Zwiększa to również siłę działania antytoksyny. Niektóre jady nie są w stanie same w wystarczającym stopniu wywołać układu odpornościowego lub połączenie dwóch lub więcej jadów skutkuje lepszą odpowiedzią antytoksyny.

Toksyczność

Śmiertelność

Kalcyseptyna jest toksyczna w małych dawkach. Brak konkretnych danych dotyczących toksyczności kalcyseptyny u ludzi. Jednak wartości LD50 _dla myszy zostały określone i można je znaleźć w poniższej tabeli:

Tryb administracji	wartość LD50 _
Zastrzyk dożylny	0,25 mg/kg
Wstrzyknięcie podskórne	0,38 mg/kg
Wstrzyknięcie dootrzewnowe	0,94 mg/kg

Toksyczność jadu

Czarna mamba może wstrzyknąć od 100 do 120 mg jadu jednym kęsem. Porównanie wyników LD ₅₀ z ilością jadu, jaką można wstrzyknąć, pokazuje, że jedno ugryzienie jest śmiertelne. Dla ludzi wystarczy dawka 10-15 mg, aby spowodować śmierć.

Inne dane

Kalcyseptyna ma wpływ na skurcze indukowane K ^{+ i aktywność kanałów Ca2 +} typu L , wyznaczono wartości IC50 i uzyskano wartości odpowiednio 230 i 430 nM _. Kalcyseptyna ma również wpływ na czynność serca. Wartość IC50 _stwierdzona dla tej tkanki wynosiła 15 nM. Wartości te określono u szczurów i myszy.

Toksyczność synergistyczna

Stwierdzono, że niektóre trójpalczaste toksyny z jadu mamby oddziałują ze sobą synergistycznie . Molekularne mechanizmy tych interakcji pozostają nieznane. Nie wiadomo również, czy kalcyseptyna wykazuje działanie synergistyczne z innymi związkami jadu.

Wpływ na zwierzęta

Kalcyseptynę badano in vivo i in vitro na wszystkich rodzajach zwierząt, ale głównie na szczurach. Kalcyseptyna rozluźnia wstępnie skurczoną aortę szczura (piersiową) i drastycznie obniża ciśnienie krwi.

Spadek ciśnienia krwi wykazuje połączenie efektów krótko- i długotrwałych. Wczesny, ostry początek trwał pięć minut, a efekt mógł trwać 120 minut lub dłużej. Ponadto kalcyseptyna miała tylko niewielki wpływ na rytm serca, zmieniając go tylko nieznacznie. Ponadto może również rozluźnić tchawicy w płucach. Efekty te można wytłumaczyć relaksującym działaniem kalcyseptyny na różne mięśni gładkich . Hamujące działanie kalcyseptyny powoduje zmniejszenie lub całkowity zanik aktywności elektrycznej tych komórek. Całkowity efekt hamujący zależy od tkanki: układ sercowo-naczyniowy jest najbardziej wrażliwy, podczas gdy komórki nerwowe są mniej podatne, a komórki mięśni szkieletowych są całkowicie odporne. Ta różnica we wrażliwości tkanek jest prawdopodobnie spowodowana niewielkimi różnicami w kanałach wapniowych typu L w tych tkankach. Efekty te mogą wystąpić przy małych dawkach kalcyseptyny od 0,1 do 1 μM. W miotubach myszy prądy Ca ²⁺ wykazują wyższą amplitudę po inkubacji w kalcyseptynie (1 μM). Ten wpływ kalcyseptyny na prąd Ca ²⁺ rozwija się stosunkowo szybko. Kalcyseptyna zmienia potencjał odwrócenia prądu Ca ²⁺ w miotubach myszy. U dorosłej żaby włókna mięśni szkieletowych kalcyseptyny powoduje również zwiększony prąd Ca ²⁺ . Wzrost ten jest porównywalny ze wzrostem, który stwierdzono w mysich miotubach. W przeciwieństwie do miotub mysich kalcyseptyna nie zmieniała potencjału odwrotnego prądu Ca ²⁺ . We włóknach mięśniowych szczura po zastosowaniu kalcyseptyny stwierdzono bardzo nieznaczne zmiany napięcia skurczowego, co pokazuje nam, że peptyd miał bardzo mały wpływ na skurcz mięśni. Kalcyseptyna miała również niewielki wpływ na włókna mięśniowe żaby.

Istnieje niewielki wpływ kalcyseptyny podczas serii powtarzających się bodźców wywołujących tężec ; kalcyseptyna zwiększała napięcie tężcowe. Średnie napięcie tężcowe po zastosowaniu kalcyseptyny było nieznacznie wyższe od wartości kontrolnej. Chociaż kalcyseptyna powoduje zwiększenie ruchu ładunku i zwiększenie napływu Ca ²⁺ przez kanały typu L, nie ma to większego wpływu na skurcz mięśnia, nawet w przypadku tężca.

Badania na szczurach i świnkach morskich wykazały, że syntetyczna kalcyseptyna i FS2 mają taki sam efekt jak ich naturalne odpowiedniki.