Latrotoksyna

Latrotoksyna to neurotoksyna o dużej masie cząsteczkowej występująca w jadzie pająków z rodzaju Latrodectus ( pająki wdowy) oraz co najmniej jednego gatunku innego rodzaju z tej samej rodziny, Steatoda nobilis . Latrotoksyny są głównymi aktywnymi składnikami jadu i są odpowiedzialne za objawy latrodektyzmu .

Opisano następujące latrotoksyny: pięć toksyn owadobójczych , określanych jako α, β, γ, δ i ε-latroinsektotoksyn, jedna neurotoksyna specyficzna dla kręgowców , alfa-latrotoksyna i jedna toksyna atakująca skorupiaki , α-latrokrustatoksyna.

α-Latrotoksyna

Najlepiej zbadaną latrotoksyną jest alfa-latrotoksyna, która działa presynaptycznie uwalniając neuroprzekaźniki (w tym acetylocholinę ) z neuronów czuciowych i ruchowych, a także na komórki wydzielania wewnętrznego ( na przykład uwalniając insulinę ). Jest to białko ~ 130 kDa , które występuje głównie w postaci dimeryzowanej lub tetrameryzowanej.

α-Latrotoksynę ( α-LTX ) można naturalnie znaleźć u pająków wdów z rodzaju Latrodectus . Najbardziej znanymi z tych pająków są czarne wdowy, Latrodectus mactans . Jad pająków wdów ( Latrodectus ) zawiera kilka toksyn białkowych, zwanych latrotoksynami, które selektywnie atakują kręgowce , owady lub skorupiaki . Jedną z tych toksyn jest α-latrotoksyna, która działa wybiórczo na kręgowce; jest nieskuteczny u owadów i skorupiaków. α-LTX ma wysokie powinowactwo do receptorów swoistych dla komórek nerwowych i wewnątrzwydzielniczych kręgowców.

Biosynteza

Podczas transkrypcji i translacji sekwencji DNA dla α-LTX powstaje nieaktywna cząsteczka prekursorowa α-LTX (156,9 kDa). Ta cząsteczka prekursorowa przechodzi obróbkę posttranslacyjną, w której powstaje ostateczne, aktywne białko α-LTX (131,5 kDa).

N-koniec cząsteczki prekursora α-LTX poprzedzony jest krótkimi hydrofilowymi sekwencjami zakończonymi skupiskiem zasadowych aminokwasów. Klastry te są rozpoznawane przez enzymy proteolityczne ( proteazy furynopodobne ), które rozszczepiają i aktywują cząsteczki prekursora α-LTX na drodze hydrolizy. C-koniec również jest rozpoznawany przez te furynopodobne proteazy i również jest odcinany.

Cząsteczki prekursorowe α-LTX są syntetyzowane przez wolne rybosomy w cytozolu i dlatego są cytozolowe w wydzielniczych komórkach nabłonkowych gruczołów jadowych. Mogą jednak łączyć się z ziarnistościami wydzielniczymi, chociaż nie są wchłaniane w świetle ziarnistości. Cytosolowa cząsteczka prekursora α-LTX jest uwalniana z komórki na drodze holokrynowej , skąd trafia do gruczołu jadowego pająka. Gruczoł ten zawiera kilka proteaz biorących udział w rozszczepianiu cząsteczki prekursora α-LTX.

Strukturę trzeciorzędową białka α-LTX można podzielić na trzy części: N-końcowe skrzydło (36 kDa), korpus (76 kDa) i C-końcową głowę (18,5 kDa). Ze względu na C-końcowe powtórzenia ankiryny, które pośredniczą w interakcjach białko-białko, monomer α-LTX tworzy dimer z innym monomerem α-LTX w normalnych warunkach. Tworzenie tetrameru aktywuje toksyczność.

Toksykokinetyka

α-LTX wpływa na zakończenia nerwów ruchowych i komórki wydzielania wewnętrznego. Nie są związane żadne główne aktywności enzymatyczne. Zamiast tego toksyna może tworzyć pory w błonach lipidowych i indukować przepływ jonów Ca2 ⁺ . Początek skutków zatrucia może wystąpić z opóźnieniem wynoszącym od 1 do 10 minut, nawet przy stężeniach poniżej nanomolowych. Przy stężeniach nanomolowych występują gwałtowne uwalnianie neuroprzekaźników. Po wybuchach zaczynają obowiązywać przedłużone okresy uwalniania w stanie ustalonym.

Stymulacja potencjałów czynnościowych małych płytek końcowych jest początkowo indukowana przez neurotoksynę, później neuroprzekaźnictwo jest blokowane w złączu nerwowo-mięśniowym. Wynika to z wyczerpania zawartości pęcherzyków synaptycznych.

Toksykodynamika

α-LTX w postaci tetramerycznej oddziałuje z receptorami ( neureksynami i latrofilinami ) na błonie neuronu, co powoduje wstawienie α-LTX do błony.

Po wstawieniu tetrameru do błony komórkowej mogą wystąpić dwa mechanizmy działania. Po pierwsze, wstawienie może prowadzić do powstawania porów i prawdopodobnie innych efektów, a po drugie, receptor może zostać aktywowany, co prowadzi do sygnalizacji wewnątrzkomórkowej. Cztery głowy tetrameru tworzą miskę otaczającą pory, które w jednym punkcie są ograniczone do 10 Å. Milimolowe stężenia Ca ²⁺ i Mg ²⁺ silnie katalizują powstawanie tetrameru, co sugeruje, że stan tetrametryczny jest zależny od kationu dwuwartościowego, podczas gdy EDTA sprzyja tworzeniu się dimeru. Z badań wynika również, że stężenia La ³⁺ wyższe niż 100 μM również blokują tetrameryzację. Tworzenie się porów może zachodzić w czystych błonach lipidowych, ale odtworzone receptory znacznie zwiększają tworzenie się porów. Błony biologiczne blokują powstawanie porów, gdy nie ma receptorów α-LTX (neureksyna, latrofilina, PTPσ). Wiadomo również, że trzy wysoce konserwatywne reszty cysteiny biorą udział w wiązaniu receptora α-LTX, ponieważ mutanty zawierające serynę zamiast reszt cysteiny nie wywoływały toksyczności. Domena N-końcowa musi być prawidłowo zwinięta, w której wiązania dwusiarczkowe muszą być funkcjonalne. Toksyna α-LTX jest wiązana przez małe białko, LMWP lub latrodektynę. Zaobserwowano, że tworzenie porów w dwuwarstwach lipidowych jest niemożliwe, gdy latrodektyna jest niedostępna. Laktrodektyna nie ma wpływu na toksyczność α-LTX.

Tworzenie się porów

Pory utworzone przez α-LTX w membranie są przepuszczalne dla Ca2 ⁺ i dlatego umożliwiają napływ Ca2 ⁺ do komórki. Ten napływ do komórki pobudliwej bezpośrednio i skutecznie stymuluje egzocytozę. Napływ kationów jest proporcjonalny do ilości porów, a tym samym do ilości zaangażowanych receptorów wyrażanych na błonie komórkowej. Również Ca ²⁺ silnie ułatwia tworzenie tetramerów , a tym samym tworzenie porów. Pory są również przepuszczalne dla neuroprzekaźników, co powoduje masowy wyciek puli neuroprzekaźników do cytozolu .

Oprócz napływu Ca ²⁺ , kanał jest mało selektywny, pozwalając Na ⁺ , K ⁺ , Ba ²⁺ , Sr ²⁺ , Mg ²⁺ , Li ⁺ i Cs ⁺ również na przejście przez membranę. Pory są otwarte przez większość czasu, z prawdopodobieństwem otwarcia równym 0,8. Większość kationów trójwartościowych blokuje kanały przy 50-100 μM, takie jak Yb ³⁺ , Gd ³⁺ , Y ³⁺ , La ³⁺ i Al ³⁺ .

Por jest przepuszczalny nie tylko dla kationów, ale także dla wody. Powoduje to obrzęk zakończeń nerwowych. Dalsze zaburzenia potencjału błonowego występują z powodu przepuszczalności małych cząsteczek, takich jak neuroprzekaźniki i ATP, przechodzących przez pory α-LTX.

Penetracja membrany

Chociaż ostatecznie wykazano tworzenie się tetramerycznych porów α-latrotoksyny , niektórzy autorzy nadal spierają się, czy jest to główny sposób działania α-latrotoksyny i uważają, że α-latrotoksyna (tetrameryczna lub nie) może przenikać przez błonę komórek docelowych do bezpośredniej interakcji z wewnątrzkomórkową maszynerią uwalniania neuroprzekaźników.

Receptory

Sugeruje się następujący mechanizm dla efektów, w których pośredniczą receptory. Opisano trzy receptory dla α-latrotoksyny:

• neureksyna
• latrofilina (alias CIRL, niezależny od wapnia receptor dla latrofiliny)
• białkowa fosfataza tyrozynowa sigma (PTPσ).

Toksyna stymuluje receptor, najprawdopodobniej latrofilinę, który jest receptorem sprzężonym z białkiem G, połączonym z Gαq/11. Dalszym efektorem Gαq/11 jest fosfolipaza C (PLC). Po aktywacji PLC zwiększa się stężenie IP3 w cytozolu, co z kolei indukuje uwalnianie Ca2 ⁺ z zapasów wewnątrzkomórkowych. Ten wzrost cytozolowego Ca ²⁺ może zwiększać prawdopodobieństwo uwolnienia i szybkość spontanicznej egzocytozy. Latrofilina z α-LTX może indukować aktywację kinazy białkowej C (PKC). PKC odpowiada za fosforylację białek SNARE. Tak więc latrofilina z α-LTX indukuje efekt egzocytozy pęcherzyków transportowych. Dokładny mechanizm musi zostać odkryty.

Sygnalizacja

Oprócz głównych skutków tworzenia porów α-latrotoksyny, inne efekty α-latrotoksyny są pośredniczone przez interakcję z latrofiliną i sygnalizację wewnątrzkomórkową (patrz transdukcja sygnału ).

Zależność struktura-aktywność (SAR)

Naturalnie występujący dimer α-LTX musi tworzyć tetramer, aby był toksyczny. Tetrameryzacja zachodzi tylko w obecności kationów dwuwartościowych (takich jak Ca ²⁺ lub Mg ²⁺ ) lub cząsteczki amfipatyczne. Cztery monomery tworzące ten tetramer są rozmieszczone symetrycznie wokół centralnej osi, przypominając czterołopatowe śmigło o średnicy 250 Å i grubości 100 Å. Domeny głowy tworzą zwartą, centralną masę zebraną razem i otoczoną domenami ciała. Skrzydła stoją prostopadle do osi tetrameru. Z powodu tej postaci tetramer zawiera kanał w kształcie gruszki w centralnej masie. Na dolnym końcu średnica tego kanału wynosi 25 Å, następnie rozszerza się do 36 Å, aby zwęzić się do 10 Å u góry.

Podstawa tetrameru (poniżej skrzydeł) ma głębokość 45 Å i jest hydrofobowa, co pośredniczy w wstawianiu do błony komórkowej. Również insercja tetrameru jest możliwa tylko w obecności określonych receptorów (głównie neureksyny Iα oraz w mniejszym stopniu latrofiliny i PTPσ) na błonie. Neureksyna Iα pośredniczy tylko w obecności Ca ²⁺ , podczas gdy latrofilina i PTPσ mogą pośredniczyć w wstawianiu bez obecności Ca ²⁺ . Tak więc z powodu kanału i wstawienia do błony komórkowej białko sprawia, że ​​komórka jest bardziej przepuszczalna dla substancji, które mogą przejść przez kanał. Substancje te to jedno- i dwuwartościowe kationy, neuroprzekaźniki, barwniki fluorescencyjne i ATP.

Toksyczność

LD50 α-LTX u myszy wynosi 20–40 μg/kg masy ciała.

LD50 jadu Latrodectus w mg/kg dla różnych gatunków: żaba = 145, kos = 5,9, kanarek = 4,7, karaluch = 2,7, pisklę = 2,1, mysz = 0,9, mucha domowa = 0,6, gołąb = 0,4, świnka morska = 0,1 .

Wkład naukowy

αLTX pomógł potwierdzić hipotezę transportu pęcherzykowego uwalniania przekaźników, ustalić zapotrzebowanie Ca ²⁺ na egzocytozę pęcherzykową i scharakteryzować poszczególne miejsca uwalniania przekaźników w ośrodkowym układzie nerwowym. Pomogło to zidentyfikować dwie rodziny ważnych receptorów powierzchniowych komórek nerwowych.

Zmutowana forma αLTX, która nazywa się αLTXN4C i nie tworzy porów, przyczyniła się do badań. Pomogło to w podejściu do rozszyfrowania wewnątrzkomórkowego mechanizmu transdukcji sygnału stymulowanego przez αLTX. Zmutowaną toksynę można również wykorzystać do badania natury i właściwości wewnątrzkomórkowych zapasów Ca ²⁺ związanych ze szlakiem transdukcji receptora toksyny i ich wpływu na wywołane potencjały postsynaptyczne. Zmutowana toksyna może być również narzędziem do wyjaśnienia endogennych funkcji αLTX.

Inne składniki jadu

Naturalną ofiarą pająków wdów są owady, aw ich jadzie znajduje się kilka insektotoksyn. Wydaje się, że latroinsektotoksyny mają podobną strukturę.

Białka o dużej masie cząsteczkowej, które zostały wyizolowane z śródziemnomorskiej czarnej wdowy ( L. tredecimguttatus ), obejmują specyficzne dla owadów neurotoksyny α-latroinsectotoxin i δ-latroinsectotoxin, neurotoksynę wpływającą na skorupiaki znaną jako latrocrustatoksyna oraz małe peptydy , które hamują angiotensynę-1 -enzym konwertujący

Oprócz opisanych powyżej latrotoksyn o dużej masie cząsteczkowej, jad Latrodectus zawiera również białka o niskiej masie cząsteczkowej, których funkcja nie została jeszcze w pełni zbadana, ale może być zaangażowana w ułatwianie wstawiania latrotoksyn do błony.